脑震荡打击酒精性脑病大鼠的死亡机制研究

摘要

1背景及目的：　　酗酒严重危害人身健康。在慢性酒精中毒的全身性毒理学作用中，脑损害表现最明显，亦最受人们关注。其常表现为性格改变，精神萎靡，认知障碍，记忆能力下降，甚至出现幻觉、妄想、躁动、抑郁、昏睡或昏迷等症状，严重者危及生命，称之为酒精性脑病。在临床及法医实践中，常遇到慢性酗酒者遭受轻微头部外伤后，出现严重临床症状，甚至死亡，然而其具体机制尚不明了，造成临床诊治及法医鉴定的困惑。　　酒精性脑病者常规影像学检测显示大脑皮质和白质萎缩，脑室脑池扩大，脑沟增宽，胼胝体及脑桥变性等；病理检查呈大脑及小脑萎缩，脑体积及质量减小。然而，这些临床-病理改变往往出现于慢性酒精中毒的晚期，甚至病人死后病理检查才发现。而酒精性脑病早期临床诊断，及其相关治疗干预一直是人们研究的方向。　　本课题组前期研究证实，慢性酒精中毒大鼠遭受轻微的脑震荡性打击后，死亡率明显高于慢性灌水-打击组和急性酒精中毒-打击组，并发现了酗酒引起脑血管退变、抑制脑红蛋白(Ngb)相关氧和能量代谢、钠钾泵功能障碍以及脑干神经元暗细胞改变、神经纤维骨架和突触结构及其受体密度减少等形态、代谢及功能变化，以上病理改变导致脑干生命中枢神经网络的应急反应和代谢效能降低，使大鼠易于失代偿性衰竭而死亡。　　在前期研究工作的基础上，本实验拟进一步探讨：　　⑴慢性酒精中毒活体大鼠脑部磁共振1H-质子振波谱(MRS)和弥散张量成像(DTI)的研究，无创性检测脑代谢物Naa、Cr和Cho的含量及神经轴索纤维的结构变化，为临床早期诊断和治疗酒精性脑病提供依据；　　⑵检测慢性酒精中毒及轻微打击作用下，以及椎管内注射NF-κB抑制剂PDTC后脑干核因子NF-κB p65和细胞因子IL-1β的表达情况，比较抑制剂PDTC干预前后灌酒打击大鼠的死亡率。探讨NF-κB p65和细胞因子IL-1β介导的炎症反应在慢性酒精中毒联合脑震荡打击导致的大鼠脑部损伤及死亡机制中的作用。　　2实验方法：　　2.1建立大鼠慢性酒精中毒及脑震荡打击模型　　成年雄性SD大鼠，体重300±50g，随机分为灌酒组、灌水组、灌水打击组及灌酒打击组，灌酒及灌酒打击组每日以食用白酒(北京红星二锅头，52％v/v)灌胃4 w，每天9:00、15:00各1次，每次10 ml/kg。灌水及灌水打击组用自来水取代白酒灌胃，方法同灌酒组。用自制单摆式打击装置制作灌水和灌酒大鼠脑震荡性打击模型。观察大鼠灌酒及打击后的生理变化，统计打击后大鼠的死亡率。取慢性灌酒大鼠脑、肝、肾、肺等器官行HE染色，观察灌酒后各器官的病理变化。用电镜观察慢性酒精中毒大鼠及脑震荡打击后脑干神经纤维微管微丝、髓鞘、神经元、线粒体等超微结构的变化。　　2.2灌酒结束后脑震荡打击前，大鼠椎管内注射NF-κB的抑制剂PDTC　　用1ml注射器穿刺L5-6椎间隙，缓慢注入100mM（溶于二甲亚砜，DMSO）的PDTC50ul，每天注射一次，共注射两次，中间间隔一天。　　2.3灌水组及灌酒组大鼠的核磁共振1H-质子波谱(1H-MRS)及弥散张量成像(DTI)扫描　　灌水组及灌酒组大鼠采用安捷伦(Agilent)7T小动物磁共振成像仪进行磁共振成像(MRI)扫描，2通道体线圈。后处理软件：Vnmrj4.0.。　　T2WI采用fsems系列扫描，氢质子波谱(1H-MRS)检测区域为脑干，采用press系列扫描。采用LCmodel软件(version6.2)后处理并定量分析脑干Naa、Cr及 Cho等代谢物的绝对浓度数据。DTI检测区域为全脑，采用Epip系列扫描。自动重建，选取脑干及额叶为感兴趣区，得出ADC、FA图及数值。　　2.4灌水及灌酒大鼠行 Morris水迷宫定位航行试验和空间探索试验，记录大鼠在第四象限的停留时间和站台穿越次数。分析大鼠慢性灌酒前后以上两个指标的变化。　　2.5用免疫荧光、Western blot等方法检测各组动物脑干活化入核的NF-κB p65表达情况，用ELISA方法检测脑干IL-1β表达水平。　　2.6椎管内注射NF-κB的抑制剂PDTC，用Western blot检测各组动物脑干活化入核的NF-κB p65表达情况，用ELISA检测脑干IL-1β表达水平。　　3统计学分析　　采用SPSS16.0统计软件(SPSS Inc., Chicago, US)分析实验数据，采用单因素方差分析(One-way ANONA)进行均数比较，LSD检验进行组间比较，方差不齐的用Dunnet’ T3检验，计量资料用?x±SD表示；用卡方检验验(Chi-square test)进行非参数资料比较。统计学检验的显著性水平定义：p<0.05为差异显著。　　4结果：　　4.1大鼠行为及体重变化　　大鼠灌酒早期出现躁动、易激惹，逐渐出现昏睡、呼吸缓慢，四肢软瘫等急性醉酒表现。随着灌酒天数的增加，大鼠逐渐出现精神萎靡、消瘦、行动迟缓、毛发稀疏、食欲差以及大便稀溏等症状，体重逐渐减轻；灌水组大鼠体重逐渐增加，灌酒结束后两组动物体重差别有统计学意义(p<0.05)。灌水大鼠脑震荡打击后出现角膜反射消失、对疼痛刺激无反应，四肢强直，1-3分钟后逐渐恢复正常；灌酒大鼠脑震荡打击后出现角弓反张、全身抽搐，呼吸由深大逐渐变为浅慢甚至消失，部分大鼠数分钟后死亡。灌酒打击大鼠死亡率为48%(12/25)；添加抑制剂 PDTC后灌酒打击大鼠死亡率下降为20%（5/25），差别有统计学意义，p<0.05。灌水打击组动物未见死亡。　　4.2大体标本及HE染色结果　　⑴灌水组大鼠皮层表面脑沟脑回清晰，未见出血及淤血。显微镜下见神经元、胶质细胞、神经纤维形态和分布正常。⑵灌水打击组大体标本见皮层表面光滑，脑沟略缩小，脑回稍模糊，未见蛛网膜下腔出血。显微镜下见神经元及胶质细胞轻度水肿，神经纤维不规则扭曲增粗，部分血管痉挛改变。⑶灌酒组大体标本见皮层表面轻度淤血，散在蛛网膜下腔出血。镜下见神经纤维排列疏松、紊乱，局部不规则增粗，散在暗神经元。⑷灌酒打击组大体标本见皮层表面淤血明显，广泛蛛网膜下腔出血。暗神经元比灌酒组更常见，脑血管痉挛扭曲。神经纤维排列紊乱，不规则增粗、扭曲、甚至断裂。各组动物均未见脑挫裂伤灶。　　慢性灌酒大鼠其他器官的病理变化：肾小球及间质上皮水肿，弥散管型。双肺弥漫大小不一白色斑块，镜下见炎细胞以细小支气管为中心聚集成脓肿灶，相互融合，部分支气管壁及血管壁被炎症细胞破坏。肝淤血肿胀，肝细胞弥漫脂肪变性，小叶周边重，实质散在小坏死灶及脓肿灶。胃壁变薄，上皮不规则坏死脱落，粘膜表面絮状物质附着。　　4.3电镜观察脑干超微结构　　灌水组神经轴索纤维粗细均匀、形态规整，神经髓鞘致密、神经微管及微丝排列规则。灌水打击组神经髓鞘散在裂隙样分层、神经轴索纤维排列松散。灌酒组神经轴索粗细不均、排列松散紊乱，神经髓鞘不规则分层，部分见脱髓鞘改变，部分神经微管微丝断裂。灌酒打击组髓鞘弥漫疏松、板层分离，脱髓鞘改变多见；线粒体肿胀空泡变，线粒体脊断裂溶解，可见暗神经元，大量神经骨架纤维断裂崩解。　　4.4核磁共振扫描结果　　灌酒组和灌水组大鼠脑部常规核磁共振扫描T2相未见明显异常。1H-MRS结果显示，灌酒组脑干 Naa、Cr和Cho绝对值均比灌水组小，差别有统计学意义(p<0.01)；DTI结果显示，灌酒额叶FA值比组灌水组小，差别有统计学意义，p<0.01；灌酒组脑干FA值比灌水组小，差别有统计学意义，p<0.05；灌酒组脑干和额叶ADC值和灌水组差别无统计学意义，p>0.05。　　4.5 Morris水迷宫结果　　灌酒组大鼠和灌水组相比，站台穿越次数明显减少，差别有统计学意义(p<0.01)；第四项限时间百分比明显减小，差别有统计学意义(p<0.01)。　　4.6 NF-κB p65免疫组织荧光染色结果　　荧光显微镜下粉红色荧光即为活化入核的NF-κB p65蛋白，灌水组和灌水打击组大鼠散在短杆状或颗粒状粉红色荧光；两者阳性细胞数差异无统计学意义，p>0.05。灌酒组大鼠脑干可见弥漫短杆状或颗粒状粉红色荧光，阳性细胞数比灌水组和灌水打击组明显增多，p<0.01；灌酒打击组可见弥漫短杆状或颗粒状粉红色荧光，阳性细胞数比灌酒组明显增多，p<0.05。　　4.7脑干NF-κB Westernblot结果　　灌水组NF-κB p65条带宽度及灰度值与灌水打击组相当，灌酒组条带明显比灌水打击组及灌水组宽，而灌酒打击组条带明显较灌酒组宽。　　灌酒打击+PDTC组NF-κB p65条带明显比灌酒打击组窄；灌酒+PDTC组条带明显比灌酒组窄。　　4.8 IL-1βELISA结果　　灌水组及灌水打击组IL-1β表达水平差别无统计学意义，p>0.05；灌酒组脑干IL-1β表达水平较灌水组及灌水打击组明显升高，p<0.01；灌酒打击组大鼠IL-1β表达水平较灌酒组明显升高，p<0.05。　　灌酒打击+PDTC组IL-1β表达水平明显比灌酒打击组低，p<0.01；灌酒+PDTC组IL-1β表达水平明显比灌酒组低，p<0.01。　　5结论：　　⑴酒精性脑病脑干核磁共振1H-MRS扫描Naa、Cr和Cho等代谢物质含量明显下降，DTI扫描FA值明显降低，提示1H-MRS及DTI扫描可早期发现慢性酒精中毒脑部神经细胞代谢物及轴索结构的异常变化，为慢性酒精中毒的临床诊治提供依据。　　⑵酒精性脑病额叶DTI扫描FA值降低，结合大鼠水迷宫实验站台穿越次数明显减少，第四项限时间百分比明显减小，提示慢性酒精中毒引起的额叶轴索纤维损伤构成了大鼠学习记忆能力障碍的病理基础；　　⑶酒精性脑病脑干核因子NF-κB p65活化及细胞因子IL-1β表达增强，脑震荡性打击后两者表达进一步增强；而椎管内注射NF-κB抑制剂PDTC后，NF-κB p65、IL-1β表达明显下降，大鼠死亡率亦下降，提示慢性酒精中毒脑组织NF-κB和IL-1互相促进，形成炎症级联反应的恶性循环，显著降低脑干生命中枢的创伤应激耐受性，在轻微脑损伤死亡机制中发挥重要作用；PDTC可降低慢性酒精中毒的脑干炎症反应及其外伤死亡率。

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缩略语释义表

第一部分 慢性酒精中毒大鼠脑部核磁共振1H-MRS及DTI研究

1引言

参考文献

2 材料和方法

3实验结果

4 讨论

参考文献

5.附图

第二部分NF-κB在慢性酒精中毒大鼠脑震荡打击死亡机制中的作用

1引言

参考文献

2材料和方法

3实验结果

4.讨论

参考文献

5. 附图

全文总结

附录

个人简介及在读期间科研及发表论文情况

致谢

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