常见肠道致病菌感染快速诊断芯片的研制与应用

摘要

细菌感染是临床的重要问题，1995年全世界世界死亡5200万人，至少1200万死于传染病，占死亡人数的32.7％，其中就包括细菌性传染病。目前培养法是细菌感染诊断的金标准，但费时长(4-7天)，而且不同的细菌培养条件也不相同，也不易同时鉴定多种细菌。国内外开展了利用分子生物学及免疫学方法对致病菌进行检测的研究，包括定性分析的PCR技术、ELISA及免疫磁珠等，但是这些方法都只是特异的对单种细菌来进行鉴定。而DNA芯片技术，作为一种大规模集成的固相杂交技术，具有高通量的特点，而且所需鉴定时间短(2天)，可能成为细菌感染检测的重要方法。因此本研究拟采用不对称PCR，荧光显色等技术建立一种检测常见肠道细菌感染的芯片系统，来对引起腹泻的常见的致病菌做一个初步的筛查，初步确定到属，然后再选择进行特异性的鉴定(如荧光定量PCR)。这样不仅能够特异的检测靶细菌感染，而且可以大大的节省临床培养所耗费的时间，有可能在临床得到广泛应用。 研究目的：建立一种快速准确的方法对引起腹泻的常见肠道致病菌做初步的筛查，并对早期的治疗和最后的诊断起指导作用。 材料和方法： 1.根据表一和表二中的引起肠道感染的常见致病菌的相关流行病学资料，确定将临床14属细菌作为研究对象。 2.收集GeneBank中临床常见的14属细菌的16SrDNA的60条序列，利用计算机中DNAStar软件对些序列进行比对，Primer5.0软件在保守区中设计通用引物，在可变区中设计特异性探针。 3.培养肠致病性大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，单核增生型李斯特菌、嗜水气单胞菌、志贺菌、伤寒沙门菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌、艰难梭菌、普通变形杆菌等常见菌的标准菌株。抽取各菌种的DNA后于-20℃下保存。 4.将cy5标记后的引物以不对称PCR方法扩增上述提取的细菌DNA后，与固定在芯片上的探针进行杂交，然后在荧光扫描仪中进行扫描，根据杂交后产生的荧光信号值强弱来判定细菌的种类。 5.收集住院和门诊腹泻病人的粪便200例及正常人粪便50例。 6.提取250例粪便的DNA，并应用此引物和探针进行检测。以传统的细菌培养作为金标准，来评价DNAmicroarray方法的敏感度，特异度，假阴性率以及假阳性率。 结果： 1.在对细菌标准株的检测中，我们建立的针对16SrRNA序列的基因芯片检测系统，能够成功的将14属的细菌鉴定到属。在纯培养物的最低检测浓度为103CFU/ml。在模拟粪便标本中的最低检测浓度为104CFU/ml。 2.在200例腹泻粪便中，DNAmicroarray检出93例阳性样本，传统培养方法检出89例。其中培养方法阳性，芯片结果阴性5例；培养方法阴性，芯片结果阳性9例。以传统的细菌培养方法作为检验的金标准，基因芯片的敏感度为94.4％，特异度为91.8％，假阳性率为5.6％，假阴性率为10％。 3.在对检测出的空肠弯曲菌(4例)和小肠结肠炎耶尔森(6例)菌同时进行real-timePCR检测，其结果与芯片结果吻合度为100％。 结论： 1.引物和探针对常见的肠道致病菌有较强的特异性。在纯培养物的最低检测浓度为103CFU/ml。在模拟粪便标本中的最低检测浓度为104CFU/ml。 2.在对临床200例粪便标本的检测中，以同时进行的粪便培养作为评价的金标准，基因芯片的敏感度为94.4％，特异度为91.8％，假阳性率为5.6％，假阴性率为10％，表明引物和探针的最低检测浓度能够应用于临床检测中。 3.DNAmicroarray方法与实时定量PCR相结合可以将细菌鉴定到种，具有重要的临床价值。

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材料和方法

结 果

讨 论

全文小结

参考文献

攻读学位期间成果

致 谢

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