荔枝果实中內源IAA与ABA的定量检测及其与落果之间的关系

摘要

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是我国南部重要的经济果树，但生产上落果严重问题极大地限制其产业的发展。荔枝落果是多因素相互协调所控制的结果，其中內源激素在其中起重要作用，尤其是IAA和ABA。液质联用(LC-MS)技术是目前公认的精确度高的內源激素检测方法，但在荔枝研究中还未被建立。本研究首先是探索并建立精确测定荔枝果实中内源IAA和ABA含量的UPLC-ESI-MS/MS方法，然后通过比较采前落果程度不同两个品种间以及饥饿胁迫处理诱导同一品种幼果脱落过程中果实中內源IAA和ABA水平变化差异，探讨荔枝果实中內源IAA和ABA的变化与落果的关系，以期为制定减轻荔枝落果生产措施提供理论依据。主要研究结果如下：　　1、建立了采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪同时测定荔枝果实中内源IAA和ABA含量的UPLC-ESI-MS/MS方法。首先主要从总离子色谱图的峰型、响应值及操作的便捷性等方面比较液液萃取外标法、分散液液微萃取外标法、液液萃取内标法三种不同前处理方法对IAA和ABA测定效果，结果发现：　　(1)液液萃取外标法无法检测到样品中IAA和ABA两种內源激素。　　(2)液液微萃取外标法无法检测到IAA，但却能较好检测ABA。通过比较不同提取时间、萃取剂及NaCl盐浓度对ABA保留行为及富集效果的影响，并对分散液液微萃取外标法体系进行了优化，优化结果显示，在提取时间为30 min，采用磷酸三丁酯做为萃取剂，盐浓度为0%时，ABA的保留行为及富集效果最好。荔枝样品经过分散液液微萃取前处理，外标法定量，ABA在线性范围内的相关系数(r2)为0.99，检出限为2.3 pg/μL，加标回收率在73.12%~107.02%，相对标准偏差小于4.0%，在两个品种荔枝样品中检测ABA的含量分别为123.24 ng/g?FW和358.91 ng/g?FW，该前处理适合荔枝样品中ABA的定量。　　(3)液液萃取内标法能够同时检测到IAA和ABA。通过比较不同抗氧化剂、提取剂、除色剂、萃取剂对目标物IAA和ABA保留行为及富集效果的影响，并对液液萃取内标法体系进行了优化，优化结果显示，荔枝样品经预冷的80%丙酮震荡浸提，石油醚除色素(除色前调 pH 至 8) ，乙酸乙酯萃取(加萃取剂前调 pH 至 3) ，在XBridgeTMBEHC18色谱柱中以流动相0.1%的甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈进行梯度洗脱，添加同位素 13C6-IAA和D6-ABA做内标定量，能够较精确地定量检测出样品中IAA和ABA含量，其中 IAA检出限为0.283 pg/μL，定量限为0.339 pg/μL，ABA检出限为0.102 pg/μL，定量限为0.943 pg/μL，IAA和ABA测定结果的相对标准偏差分别为3.75%和1.38%。　　2、采用本实验建立的UPLC-ESI-MS/MS方法，分析测定了果实快速膨大期间(采前约1个月，5月23日-6月20日)‘糯米糍’和‘桂味’果皮和果肉中的IAA和ABA含量，结果发现‘糯米糍’果皮和果肉中ABA含量分别在397~2640 ng/g·FW和530~916 ng/g?FW之间；‘桂味’果皮和果肉中ABA含量分别在196~1805 ng/g?FW和247~600 ng/g?FW。采前落果期间(6月6日至6月20日)，‘糯米糍’和‘桂味’荔枝累积落果率分别为39.43%和12.86%，‘糯米糍’果皮和果肉中的ABA含量变化明显较采前落果极少的‘桂味’荔枝剧烈，除6月20日果皮中的ABA含量低于‘桂味’外，其他时间点基本都高于‘桂味’，而IAA的含量两品种在果肉中含量和变化趋势基本一致，果皮中的含量6月13日‘糯米糍’显著低于‘桂味’，但在6月20日则又显著高于‘桂味’。据此，认为这‘糯米糍’采前落果显著高于‘桂味’的原因可能与其果肉中ABA含量高有关。　　3、结果母枝环剥去叶饥饿胁迫(GPD)处理极显著促进‘怀枝’幼果(花后25d)脱落，处理后3d之内，GPD处理和对照差异不大，落果率大约5 %，但处理后4d，GPD处理的累积落果率达到58.5 %，处理后5 d更是上升92 %，而对照在处理后5d的累积落果率只有13 %。分析测定了结果母枝环剥去叶饥饿胁迫(GPD)处理与对照‘怀枝’幼果(花后25d)中內源IAA和ABA含量，结果发现，经GPD处理后，‘怀枝’幼果中IAA和ABA含量均增加。具体表现为：IAA含量在处理后第1 d和第2 d在110 ng/g?FW左右，与对照无差异，但在第3 d猛然增加，达到1612 ng/g?FW，在第4 d稍微有所降低，第5 d达到最高值1732 ng/g?FW，而对照组IAA含量在第3 d到5 d在125~441 ng/g?FW变化，但变化幅度不大；ABA含量在处理后第1~3 d与对照组无明显差异，均在150 ng/g?FW左右，在第4 d开始处理组ABA增加达到246 ng/g?FW，显著高于对照组(206 ng/g?FW，第5 d达到顶峰494 ng/g?FW，极显著高于对照组(234 ng/g?FW)。此外，在荔枝基因组数据库(http://litchidb.genomics.cn/page/species/index.jsp)筛选得到7个荔枝ABA合成代谢关键酶基因NCEDs，荧光定量检测它们在GPD处理诱导‘怀枝’幼果脱落过程中的表达规律发现，LcNCED1、LcNCED3和LcNCED5响应饥饿胁迫。据此认为，GPD处理促进幼果脱落可能与其促进ABA在果实中积累和抑制果实中IAA输出有关，LcNCED1、LcNCED3和LcNCED5可能是引起ABA含量上升的关键基因。

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1 前言

1.1 生长素及其与植物器官脱落的关系

1.2 脱落酸及其与植物器官脱落的关系

1.3 植物内源激素定量检测的研究

1.3.1 定量方法的选择

1.3.2 样品前处理准备

1.3.3 检测方法

1.3.4 液质联用技术及其在检测植物內源激素上的应用

1.3.5 荔枝上内源激素定量检测的研究进展

1.4 本研究的技术路线及主要内容、目的意义

2 材料与方法

2.1 供试材料及处理

2.2 实验试剂、设备及来源

2.3 试验方法

2.3.1 坐果动态观察

2.3.2 荔枝果实中IAA和ABA含量方法定量检测

2.3.3 内源激素含量的计算方法

2.3.5荧光定量的引物设计

2.3.7qRT-PCR分析

2.4 统计分析

3 结果与分析

3.1 荔枝果实中IAA和ABA含量定量检测方法

3.1.1 UPLC-ESI-MS/MS的总离子色谱图

3.1.2 液液萃取外标法

3.1.3 分散液液微萃取外标法

3.1.4 液液萃取内标法

3.1.5 三种前处理方法比较

3.2荔枝中ABA合成基因NCED序列比对及聚类分析

3.2.1 NCED多序列比对

3.2.2 NCED基因的进化关系

3.3 采前落果严重程度不同两个荔枝品种果实中IAA和ABA含量比较

3.3.1 采前落果率比较

3.3.2 IAA和ABA含量比较

3.4 碳水化合物胁迫对荔枝幼果脱落、IAA和ABA含量及NCEDs基因表达的影响

3.4.1对‘怀枝’幼果脱落的影响

3.4.2 对IAA和ABA含量的影响

3.4.3 对NCEDs基因表达的影响

4 讨论与结论

4.1 荔枝中ABA和IAA LC-MS检测法探究

4.2 植物內源激素ABA和IAA与荔枝落果之间的关系

4.3ABA合成基因NCED的鉴定及其在荔枝幼果脱落时的转录表达

4.4 结论

致 谢