荔枝CWIN和CIF基因的启动子分析和龙眼相应基因的克隆

摘要

荔枝与龙眼均属于华南四大珍果,具有较高的营养价值与食用价值,深受消费者喜爱.种胚败育即"焦核"是一种果实发育过程中常见的遗传现象,种子大小也是评定龙眼和荔枝的品质指标之一.一般而言,焦核果可食率高,品质较好.优质传统的荔枝焦核品种有广东的‘糯米糍’、'桂味',福建的'兰竹'等.龙眼在生产上没有稳定的焦核品种,但小核性状如广东的'石硖'是龙眼优良品种的重要特征,也受到生产者与研究人员的重视.迄今为止,龙眼与荔枝种胚败育的研究大部分集中组织结构观察和生理生化变化,种胚败育的内在分子机制研究报道很少.　　本项目组前期研究发现,细胞壁酸性转化酶(CWIN)及其抑制子(CIF)在荔枝种子发育过程中起重要的作用,通过病毒诱导基因沉默(VIGS)技术沉默荔枝的LcCWIN2 和LcCWIN5基因,发现前者可使大核荔枝的种子变小,后者使得败育率增加,证实LcCWIN2 和LcCWIN5在种胚发育中起到重要作用.龙眼与荔枝同属于无患子科,属于具假种皮的果实,龙眼种子的大小是影响龙眼品质的重要因素,龙眼的种子发育与细胞壁酸性转化酶及其抑制子的关系如何?荔枝细胞壁酸性转化酶及其抑制子在不同种子发育类型品种差异表达的原因是什么?这些均是亟待回答的问题.本研究主要通过比较荔枝CWIN和CIF启动子的差异,探索这些基因差异表达的内在原因.在龙眼方面,克隆细胞壁酸性转化酶及其抑制子基因,比较它们与荔枝及其他物种相应基因的同源性,尝试将成功沉默CWIN诱导大核荔枝成焦核的VIGS实验体系运用到龙眼上,探讨细胞壁酸性转化酶在龙眼种子发育中的作用.在VIGS实验过程中,发现农杆菌生物胁迫可引起龙眼落果,本研究同时还探讨农杆菌在龙眼疏果的作用.主要研究结果如下:　　1. 克隆了种子发育正常荔枝品种'黑叶'、败育品种'糯米糍'、部分败育品种'妃子笑'的LcCWIN2、LcCWIN5基因前2000 bp序列,序列对比发现'糯米糍'与其他两个品种有明显的差异.用PlantCARE分析发现这些差异均存在胚乳相关或增强性的顺式元件,可能会影响启动子的活性.　　2.克隆了7个种子发育不同的荔枝品种的LcCIF基因前2000 bp,序列对比发现有两个明显规律性的差异:(1)有一部分品种的-200 bp有一段404 bp的2次重复的序列,另一部分品种只含一段404 bp序列,不具有重复性.(2)无重复序列的基因在-1462 bp或有重复序列的基因在-1870 bp的位置有SNP的差异.上述两点,'糯米糍'均与'黑叶'和'妃子笑'有明显区别.　　3.用GUS定性检测与双荧光报告基因检测发现'黑叶'LcCIF基因前2000 bp有启动子活性,含 LcCIF的启动子核心区域.可同样位置,'糯米糍'LcCIF 基因前2404 bp却不显示启动子活性.两者差异的404 bp序列被克隆出来,连接到NOS组合型启动子后作双荧光报告基因检测,发现梯度增加404 bp序列,NOS组合型启动子活性递减.　　4. 克隆获得龙眼的5个CWIN基因和1个抑制子CIF全长,分别命名为DlCWIN1、DlCWIN2、DlCWIN3、DlCWIN4、DlCWIN5与DlCIF,它们的基因全长分别为1713 bp、1722 bp、1734 bp、1734 bp、1740 bp与477 bp,氨基酸数目分别为570、573、577、577、579与158.生物信息学分析结果确认所克隆序列为目标序列,并发现龙眼与荔枝的CWIN与CIF序列高度相似性.　　5.用Real-Time PCR分析了5个DlCWINs基因和1个DlCIF在不同组织和的表达模式,发现DlCWIN1、DlCIF在叶片的表达量最高;DlCWIN2主要在种胚、种皮和'石硖'的成熟叶表达;DlCWIN3 主要在花器官与叶片中表达,DlCWIN4 也在花器官中表达较高,而 DlCWIN5 则在花器官特异高表达,在雌花和雄花的表达量是其它组织的几百倍.在果实发育过程中DlCWIN1和DlCWIN2随小果发育表达上升,其余三个基因特别是 DlCWIN5 在雌花盛花期表达最高,在盛花期后表达量急剧下降.DlCIF在果实表达均较低,但在花后15天后的'石硖'果实出现一个表达高峰.　　6. 用VIGS沉默DlCWIN5,未发现处理的龙眼出现焦核现象.花后21-30天注射处理的龙眼,仅发现'双孖木'种子有明显变小的现象.盛花时'储良'受DlCWIN5沉默处理后,其种子和果实均有明显变小,但未达到显著水平.这些结果说明荔枝的VIGS 体系可能在龙眼上运用侵染率较低,具体的实验体系有待进一步优化,或者DlCWIN5在龙眼种胚发育的作用较弱.　　7. 在VIGS实验中发现pTRV2-Empty的农杆菌(OD600=1.0)处理有显著的疏果作用.进一步探讨不同浓度农杆菌的疏果效应,发现不同浓度的农杆菌疏果效果相近,可减少近30%的坐果量,OD600= 1.0和1.5农杆菌在疏果的同时果实明显增大,可溶性固形物明显提高,而OD600= 2.0农杆菌虽然疏果效果显著但果实明显变小,可溶性固形物降低,可见OD600=1.0至1.5之间是'储良'龙眼农杆菌疏果的适宜浓度.

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