猪急性腹泻综合征冠状病毒的回顾性检测、分离鉴定及荧光定量探针法的建立

摘要

猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus， SADS-CoV）作为一种新发现的冠状病毒，属于冠状病毒科Alpha冠状病毒属，是有囊膜包被的单股正链RNA病毒，自2017年首次在中国猪场发现和报道以来，已经在广东清远地区猪场引发了严重的仔猪腹泻疫情。　　本研究对收集自广东地区45个猪场的236份腹泻病料进行回顾性检测，以确定SADS-CoV的最早出现时间及分布情况。结果表明，SADS-CoV至少在2016年7月前就已经在猪场出现，目前广东地区11个猪场检出为SADS阳性。腹泻病原的混合感染调查结果显示SADS-CoV的阳性检出率为43.5 %，仅次于PEDV的阳性检出率（78.2 %），而SADS-CoV-PEDV混合感染的类型也最为普遍。对SADS-CoV阳性猪场腹泻病料进行测序分析，共获得两条SADS-CoV全基因组序列、五条N基因序列和五条S基因序列，序列比对显示所得五个阳性猪场的序列相似性高达99 %-100 %，系统遗传进化分析表明研究中所获得的所有 SADS-CoV 序列与先前报道的SADS-CoV毒株序列处在同一AlphaCoVs分枝并且与蝙蝠冠状病毒HKU2毒株有着最接近的亲源关系。　　与此同时，本研究建立了一种针对SADS-CoV的快速可靠的鉴定和定量的诊断方法。依据SADS-CoV N基因保守区域设计并合成了特异性的引物和荧光探针，建立了一种 TaqMan 探针法实时荧光定量 PCR 检测方法。特异性试验结果显示，此方法中的引物和探针与其他十几种猪病原不发生交叉反应，特异性良好；检测灵敏度是普通RT-PCR的10倍，174份临床样品中，探针法SADS-CoV阳性检出率为70.69 %，普通RT-PCR检出率为51.15 %。这些数据证明了SADS-CoV TaqMan探针法具有高度的灵敏性（检出下限为1×101 copies/μL）、特异性和可重复性（变异系数<2%），是一种适用于临床SADS-CoV快速检测和准确定量的方法。　　本研究以四个 SADS-CoV 阳性猪场的仔猪肠道研磨物悬液为材料进行病毒分离鉴定。在添加8 μg/mL胰酶的条件下，SADS-CoV能在Vero细胞中稳定增殖并出现明显病变，从而成功分离出 4 株 SADS-CoV 病毒株(SADS-CoV-CN/GDDCD/2017、SADS-CoV-CN/GDWT/2017、SADS-CoV-CN/GDDE/2017以及SADS-CoV-CN/GDST/2017)。对4株SADS-CoV病毒株进行全基因组序列测定，序列比对结果表明，从细胞分离出的SADS-CoV毒株彼此间以及与已有的SADS-CoV毒株相比相似性在99 %以上。在电镜下可以观察到明显的冠状病毒粒子，用间接免疫荧光方法检测，可以看到胞浆部位有特异性荧光，以上结果证明成功分离到4株SADS-CoV病毒株。为了确定SADS-CoV分离株对仔猪具有致病性，用第9代WT分离株（TCID50为106.625/mL）对3天龄无腹泻病原感染的仔猪进行动物回归试验，攻毒组和对照组各6头，分别口服6 mL病毒液和DMEM，攻毒后每天记录临床症状并检测腹泻病原。结果显示，攻毒后48 h，攻毒组全部水样腹泻，体重下降，腹泻病原检测只有攻毒组呈SADS-CoV阳性。到攻毒后第4 d，攻毒组仔猪3/6死亡，而对照组仔猪表现正常。在攻毒后第2 d、3 d、4 d剖检仔猪，可观察到攻毒组仔猪肠道变得薄而透明，肠腔充满黄色水样，对照组无明显症状。各组织器官带毒量检测结果显示，SADS-CoV具有小肠嗜性，在小肠部位（空肠、回肠、十二指肠，肠系膜）带毒量相对较高。动物回归试验证明SADS-CoV分离病毒株能引起仔猪腹泻等临床症状，具有致病性。

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