抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合的内生生防菌的构建

摘要

甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）是甘蔗鞭黑穗病（Sugarcane Smut）的病原菌。甘蔗鞭黑粉菌需要两个不同交配型的单倍体担孢子通过有性配合形成双核菌丝才具有侵染甘蔗的能力，进而产生危害。病原菌在植物生长、侵染受植物体内的环境、信号等影响，其中包括植物激素对病原菌生长分化的影响。不同的植物激素在植物生长过程中起到不同的生理作用，其中包括与植物防御相关的反应，例如：茉莉酸(Jasmonic Acid, JA)和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate, MeJA)。大量研究表明，茉莉酸主要参与植物虫害防御相关的反应，而茉莉酸和茉莉酸甲酯均诱导植物病原菌防御相关基因的表达。本文主要筛选鉴定对甘蔗鞭黑粉菌有性配合具有抑制作用的植物或微生物小分子化合物，并拟通过改造甘蔗内生菌使之产生抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合的化合物达到病害防控的目的。具体结果如下：　　1.抑制甘蔗鞭黑粉菌小分子化合物筛选：体外培养条件下，200μM、400μM、800μM浓度的茉莉酸甲酯均能有效抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合。　　2.茉莉酸甲酯合成酶的筛选：植物茉莉酸甲基转移酶(Jasmonate MethylTransferase, JMT)能以茉莉酸为底物，以S-腺苷蛋氨酸（SAM）为甲基供体，催化甲酯化茉莉酸产生。文献报道，茉莉酸在苗期植物体内含量相对较高，而茉莉酸甲酯在此阶段几乎检测不到，因而无法在此阶段有效抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合，及其后的菌丝侵染。所以本研究主要通过引入茉莉酸甲基转移酶来提高苗期植物的茉莉酸甲酯含量，以期抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合与系统侵染。　　3.将茉莉酸甲基转移酶克隆到pRSFDUET-1表达载体，使用T7诱导表达启动子驱动其表达。pRSFDUET-1（JMT）表达质粒首先转入大肠杆菌进行活性测试。结果表明转入大肠杆菌的JMT表达质粒在添加IPTG诱导、含有茉莉酸为底物、以及SAM为甲基供体的培养条件下，能有效催化茉莉酸甲酯的生成。　　4.筛选用于茉莉酸甲基转移酶转化的甘蔗内生菌：由于植物转基因的难度以及内生菌与植物长期共生具有很好的定植能力，本研究拟通过改造甘蔗内生菌引入茉莉酸甲基转移酶，生成茉莉酸甲酯以期对甘蔗鞭病害具有防控效果。初步分离得到79株甘蔗叶片内生细菌，其中一株具有抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合作用，命名为CGB10。初步种属鉴定确定CGB10为伯克氏菌属(Burkholderia sp.)。　　综上所述，本研究发现茉莉酸甲酯能抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合与菌丝生长，植物茉莉酸甲基转移酶能在大肠杆菌诱导表达并具有催化茉莉酸甲酯生成的活性，本研究鉴定出大量来源于甘蔗幼叶的内生细菌，可用于异源表达茉莉酸甲基转移酶从而具有被改造为甘蔗鞭黑穗病生防细菌的潜力；其中一株伯克氏菌属的内生菌CGB10在体外培养条件下能抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合。

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