小檗碱对拟南芥根部thalianol和marnera基因簇作用的研究

摘要

小檗碱是一种常见的季铵类异喹啉类生物碱。本文以拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）为实验材料，利用RNA-Seq和蛋白iTRAQ技术进行研究，在此基础上，主要以thalianol基因簇和marneral基因簇为研究对象，探讨了小檗碱最早响应的分子作用靶标，以期阐明小檗碱的除草作用机理。　　为了深入了解小檗碱对植物根部的抑制作用，确定小檗碱作用的最低浓度和最早时间点，利用DR5-GFP拟南芥转基因材料，以小檗碱对拟南芥鲜重和根长抑制率的IC50为基础（分别是6 mg·L-1和0.25 mg·L-1），分别用0.25 mg·L-1小檗碱处理生长7 d的拟南芥2 h，2.5 h，3 h，用6 mg·L-1小檗碱处理0.5 h，1 h，通过激光共聚焦观察生长素的分布情况。结果发现，0.25 mg·L-1小檗碱处理拟南芥根，处理后3 h开始对生长素的分布产生影响；6 mg·L-1小檗碱处理拟南芥根，处理后1 h开始对生长素的分布产生影响。　　为了进一步从分子水平上揭示小檗碱的作用机制，找出小檗碱最早响应的分子靶标，本研究通过RNA-Seq和蛋白iTRAQ技术，对小檗碱作用的相关分子机制进行了挖掘和分析。RNA-Seq结果中，共筛选出825个差异表达基因，有422个上调的基因和403个下调的基因，其中下调基因为本研究的关注对象。结合基因功能注释，差异表达基因GO功能分析和KEGG Pathway功能分析，有20个差异显著的代谢途径（P＜0.05），且有13个为差异极显著的代谢途径（P＜0.01）。在这些差异极显著的代谢途径中，倍半萜和三萜类生物合成（sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis）通路是本文的重点研究对象。这个通路共有59个基因，占所有通路注释基因的0.31%，其中差异表达基因有6个，占所有差异表达基因的1.03%。而thalianol基因簇和marneral基因簇是本研究中筛选出的小檗碱分子作用靶标；thalianol基因簇包含thas， thah，thad，ACT这四个基因，marneral基因簇包含MRN1，mro，CYP705A12这三个基因。　　蛋白iTRAQ分析结果中，有646个差异表达的蛋白，其中上调蛋白236个，下调蛋白410个，结合蛋白功能注释，差异表达蛋白GO功能分析和KEGG Pathway功能分析，有 12 个差异显著的代谢途径，且差异表达蛋白在嘌呤代谢（ purine metabolism），淀粉和蔗糖代谢（starch and sucrose metabolism）和嘧啶代谢（pyrimidine metabolism）这些通路中含量最多。　　为了进一步从基因水平上验证小檗碱响应的最低浓度，以野生型拟南芥为材料，用0.25 mg·L-1 分别处理0 h，0.5 h，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h，3.5 h和4 h，通过RT-PCR，观察thas，thah和thad的基因表达量，结果发现，这三个基因均在3 h时表达量最低，分别为0.22，0.03和0.13。与激光共聚焦观察DR5-GFP生长素的分布情况得出的结果一致。　　利用野生型拟南芥，和七种T-DNA插入突变体：thas突变体，thah1-2突变体， thad1-1突变体，ACT突变体，MRN1突变体，mro突变体和CYP705A12突变体，分别用0.25 mg·L-1 ， 6 mg·L-1小檗碱处理生长7 d的拟南芥根部，并取其根部进行RT-PCR，结果发现，用0.25 mg·L-1小檗碱处理3 h后，thas，thah，thad，ACT，MRN1， mro，CYP705A12，这七个基因在这八种拟南芥中，表达量均明显降低，这说明，thalianol基因簇和marneral基因簇是小檗碱最早响应的一个靶标。　　利用野生型、thas突变体、thah1-2突变体、thad1-1突变体、ACT突变体、MRN1突变体、mro突变体和CYP705A12突变体这八种拟南芥，分别用0.25 mg·L-1和6 mg·L-1小檗碱处理7 d和14 d，结果发现，7 d时，在0.25 mg·L-1和6 mg·L-1小檗碱作用下， thah1-2和thad1-1突变体的根比野生型拟南芥的根明显增长，14 d时，thah1-2突变体的根在0.25 mg·L-1时仍然表现出了比野生型拟南芥明显增长的现象。　　对这两个基因簇的上游调控基因arp6和hta9进行了RT-PCR，发现和对照组相比，在小檗碱的作用下其表达量没有变化，这说明小檗碱没有影响到thalianol和marneral基因簇的上游调控因子。　　综上所述，thah和thad基因是小檗碱在thalianol基因簇中主要的初始作用位点。小檗碱对植物根部的基因作用位点之一是倍半萜和三萜类生物合成（sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis）通路中的thalianol基因簇和marneral基因簇，主要是通过抑制thah和thad基因的表达，影响其正常代谢途径，导致积累有害中间体，从而对植株造成伤害。但没有影响到这两个基因簇的上游调控因子。

目录

第一个书签之前

1.1小檗碱的研究现状该

1.1.1小檗碱的药理应用

1.2基因簇的研究进展

1.2.1原核生物基因簇

1.2.2真核生物基因簇

1.2.3植物基因簇

1.3 三萜化合物

1.4 转录组测序和蛋白iTRAQ

1.4.1 转录组测序

1.4.2 蛋白iTRAQ

1.5 立题依据和思路

1.6 研究内容

2.1实验材料

2.1.1供试材料

2.1.2主要仪器设备

2.1.3试验药品和试剂

2.1.4引物设计

2.2小檗碱除草分子机理研究

2.2.1不同浓度小檗碱对生长素分布的影响研究

2.3转录组测序

2.3.2 数据分析

2.4 iTRAQ定量蛋白组学ue5d2

2.5基因蛋白关联分析

2.6 小檗碱的分子作用机制

2.6.1 小檗碱对不同时间点的野生型拟南芥中基因表达量的影响

2.6.1.1 收取拟南芥根部样品

2.6.1.2 拟南芥根部总RNA的提取及实时荧光定量PCR

2.6.3 小檗碱对不同种类拟南芥的表型验证

2.6.4 小檗碱对thalianol和marneral两个基因簇上游调控因子的影响

3.1.1 不同浓度小檗碱对生长素分布的影响研究

3.2 转录组测序

3.2.1 测序数据分析

3.2.2 基因表达量及差异基因表达分析

3.2.3 差异基因表达分析

3.2.4 差异表达基因GO功能分析

3.2.5 差异表达基因的KEGG Pathway富集分析

3.2.6 小檗碱作用靶标基因的确定

3.3 iTRAQ

3.3.1 数据统计分析

3.3.2 蛋白质iTRAQ定量以及差异蛋白表达分析

3.4 转录组和蛋白组关联分析结果

3.4.1 关联数量统计

3.4.2 定量关联分类

3.4.3 关联结果GO功能注释

3.4.4 关联结果Pathway分析

3.5 小檗碱作用靶标基因的RT-PCR验证

3.5.1 小檗碱对不同时间点的野生型拟南芥中基因表达量的影响

3.5.2 小檗碱对不同种类拟南芥中 thalianol 和 marneral 基因簇中各基因表达量

3.5.3 小檗碱对不同种类拟南芥的表型验证

3.5.4 小檗碱对thalianol和marneral基因簇上游调控因子的影响

4 讨论

4.1 小檗碱的分子作用机制

4.1.1 小檗碱最早响应时间点和最低响应浓度的确定

4.1.2 转录组测序和蛋白iTRAQ定量分析

4.1.3 小檗碱作用靶标的确定

4.1.4 小檗碱最初响应靶标的验证

4.2 有待进一步解决的问题

4.3本论文的创新之处

5 结论

致 谢

参 考 文 献

附录