新型Axin1结合蛋白C9orf140负反馈调控Wnt/β-catenin信号通路的分子机制

摘要

Wnt（wingless-type MMTV integration site family）信号通路是生物体中一条高度保守的信号通路，因激活该通路的配体蛋白为Wnt蛋白而命名。Wnt信号通路对生物体的胚胎发育过程十分重要，而且还与人类肿瘤和癌症的发生和发展有密切的相关性。通常所提到的Wnt信号通路主要是指由β-catenin介导的经典的（canonical）Wnt信号通路，即所谓的Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路的激活与否取决于细胞质中的关键因子β-catenin是否能够累积并进入细胞核对下游靶基因进行调控，该通路目前被鉴定的靶基因主要与细胞增殖、干细胞维持及肿瘤发生相关。Wnt/β-catenin 信号通路涉及的关键调控步骤由位于细胞质中的 β-catenin 降解复合体（destruction complex）介导。降解复合体由中央脚手架蛋白Axin和其他β-catenin结合蛋白及蛋白激酶等组成，对β-catenin的磷酸化、泛素化及被蛋白酶体降解的过程进行精密的调控。目前，越来越多的参与到Wnt/β-catenin信号通路活性稳态调控过程中的因子被陆续地发现。尽管如此，这些调控因子的相互作用和具体的调控分子机制仍有待于被深入地阐述。　　C9orf140 是近年来在寻找肿瘤发生过程中差异表达基因的研究中被筛选到并克隆的一个新鉴定的基因，目前越来越多的实验证据显示在多种肿瘤细胞系及肿瘤组织中均能检测到C9orf140的特异表达，包括胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、乳腺癌等。C9orf140可能与肿瘤发生密切相关，其特异表达与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭有关。C9orf140的表达量还具有细胞周期依赖性，在细胞周期的G1和M期高于S和G2期，在M期表达量最高。细胞周期的紊乱是肿瘤发生的最重要的特征之一， C9orf140可能参与细胞周期的调控，进而在肿瘤发生中发挥作用。目前的研究结果显示，C9orf140可能具有致癌基因的特征，可能成为临床肿瘤和癌症治疗中潜在的诊断标志和药物治疗分子靶点。然而，目前关于C9orf140与其他蛋白相互作用及参与信号通路调控方面的报道少之又少，C9orf140参与细胞中哪些信号通路的调控及这些通路与C9orf140生物学功能的发挥之间的关联性值得深入研究。　　本研究首先通过串联亲和层析偶联质谱鉴定的技术，发现了C9orf140是一个新型的Axin1的结合蛋白，并通过一系列体外的生化和分子实验，包括免疫沉淀、pull-down及免疫荧光等实验，验证了C9orf140蛋白与Axin1蛋白的相互作用，然后我们进一步确认了C9orf140蛋白的N端和Axin1的502-740位氨基酸是二者相互作用的关键结构域。接着我们运用了常用于检测Wnt/β-catenin信号通路活性的TOPFlash报告基因检测系统，并结合Western blot和RT-PCR等实验，鉴定了C9orf140是Wnt/β-catenin信号通路的一个负调控因子。进一步对 C9orf140 调控机制的研究发现，C9orf140 作用于β-catenin的上游，可以与蛋白磷酸酶PP2A（protein phosphatase 2A）竞争与β-catenin降解复合体脚手架蛋白Axin1的结合，导致β-catenin磷酸化的平衡状态遭到破坏，进而抑制Wnt3A对β-catenin量的累积的诱导。而且我们还发现，Wnt可以通过依赖于β-catenin的途径诱导C9orf140的表达上调，我们推测C9orf140可能介导了一种负反馈调节机制，即 Wnt 诱导 C9orf140 的表达上调形成负反馈回路，通过C9orf140与Axin1的相互作用来抑制Wnt/β-catenin信号通路。　　我们的研究是首次从蛋白质相互作用和信号通路的角度对近年来新鉴定的基因C9orf140进行的研究，也首次发现了C9orf140是Axin1的一个结合蛋白，并以负反馈的方式对Wnt/β-catenin信号通路进行调控。我们的研究进一步地丰富了现有的对于生物体内Wnt/β-catenin信号通路实现精确调控的分子机制，也为C9orf140的新功能的发现提供了实验证据，为后续深入研究C9orf140与癌症的关系，明确C9orf140在肿瘤发生中的作用做出了一定的贡献。

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