鸡两种瑞利绦虫线粒体序列比较分析及PCR–HRM方法的建立

摘要

瑞利绦虫主要寄生于鸡、火鸡、鸽、孔雀等的小肠中，呈世界性分布，通常的症状为消化不良、腹痛、翅膀下垂、食欲减退、消瘦等，严重时可引起鸡死亡，导致经济的损失。寄生虫的线粒体基因可提供丰富的遗传标记，鸡瑞利绦虫有多种，目前，只有四角瑞利绦虫线粒体基因组被报道出来，而且应用分子生物学方法对瑞利绦虫进行鉴别的报道较少，本论文研究的主要内容是扩增棘沟瑞利绦虫线粒体全基组并进行棘沟、四角瑞利绦虫线粒体的比较分析，并建立四角瑞利绦虫和棘沟瑞利绦虫PCR–HRM鉴别方法。　　首先，对从广东省内采集到的鸡源瑞利绦虫进行形态学和分子生物学鉴定。从形态学上，对于头节完整的瑞利绦虫虫体，根据头节特征性形态能初步鉴定虫种。进一步以保守引物NC5/NC2扩增核糖体ITS序列，将扩增得到的序列进行BLAST比对和序列分析，对所采集到的所有虫体进行分子生物学鉴定。本研究首次报道了四角瑞利绦虫的ITS序列，分析显示收集到的样品均为棘沟瑞利绦虫或四角瑞利绦虫，未发现有轮瑞利绦虫，说明广东省内流行的是棘沟瑞利绦虫和四角瑞利绦虫。　　其次，以保守引物JB3/JB4.5对棘沟瑞利绦虫和四角瑞利绦虫线粒体cox1部分序列进行PCR扩增，将扩增得到的序列结果进行遗传变异分析和基因突变分析。pcox1的片段长度为381 bp，棘沟瑞利绦虫与四角瑞利绦虫种内差异较小，分别是0%～1%和 0%～1.6%，种间差异显著，为3%～10%，可为物种间系统发育分析和寄生虫鉴定提供合适的遗传标记。同时以获得的pcox1序列和已发表的四角瑞利绦虫全基因组序列为基础，进行棘沟瑞利绦虫线粒体全基因组扩增引物的设计。对棘沟瑞利绦虫线粒体全基因组进行扩增和测序，并与已报道的四角瑞利绦虫线粒体全基因组进行比较分析。比较发现，棘沟瑞利绦虫线粒体全基因组全长为14042 bp，比四角瑞利绦虫线粒体全基因组少402 bp，两种绦虫基因组的组成基本一样，都是由12个蛋白编码基因， 2个rRNA基因及22个tRNA基因组成。棘沟瑞利绦虫线粒体基因组有两个AT富含区，长度分别为166 bp和699 bp，棘沟瑞利绦虫线粒体基因均以ATG作为起始密码子，以TAG/TAA/T作为终止密码子，而在四角瑞利绦虫中多以ATG/ATA为起始密码子，以TAA/TAG作为终止密码子。以猪蛔虫为外群，构建绦虫的系统发育树，结果显示棘球属、带属、膜壳属、叠宫绦虫属、双叶槽属聚集为一支，瑞利属独占一支。本研究获得棘沟瑞利绦虫线粒体基因组全序列并对其特点、结构及与其他绦虫的进化关系分析，填补寄生绦虫线粒体全基因组相关研究的空白，对绦虫的系统发生学和群体遗传学研究极有意义。　　最后，基于上述四角瑞利绦虫和棘沟瑞利绦虫的研究，以核糖体 ITS、线粒体序列作为遗传标记设计引物，建立四角、棘沟瑞利绦虫的PCR–HRM鉴别方法，为鸡绦虫病的诊断和治疗提供有效的手段。本研究以筛选的引物 HRM5F/HRM5R 建立的PCR–HRM鉴别诊断技术能够很好的将四角、棘沟瑞利绦虫区分开来，在对PCR–HRM鉴别方法的重复性、敏感性、特异性和有效性的试验中，批内重复和批间重复效果均良好，四角瑞利绦虫可测出的最低浓度为175.37×10-10 ng/μL，棘沟瑞利绦虫可测出的最低浓度为 260.39 × 10-10 ng/μL ，在 PCR–HRM 实验的特异性检测中，引物HRM5F/HRM5R特异性良好，仅扩增出四角、棘沟瑞利绦虫，对于鸡的其他一些常见寄生虫均不能扩增出来，结果显示建立的四角、棘沟瑞利绦虫的PCR–HRM方法具有快速、敏感、特异的特点，对收集到的四角、棘沟瑞利绦虫样品DNA进行PCR–HRM的鉴定，结果显示PCR–HRM鉴定结果和测序鉴定结果一致，说明建立的PCR–HRM可适用于检测和鉴别四角、棘沟瑞利绦虫。　　本研究首次获得棘沟瑞利绦虫线粒体全基因组序列，分析了四角、棘沟瑞利绦虫的ITS序列和cox1部分序列，首次建立PCR–HRM鉴别方法，不仅丰富了瑞利属绦虫的线粒体基因序列数据库，为绦虫的比较基因组学和遗传进化研究提供了重要的资料；而且建立的PCR–HRM方法为鸡瑞利绦虫病的诊断和防控奠定了基础。

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