猪场环境中噬菌体携带耐药基因的分布和传播研究

摘要

随着抗菌药物在畜禽养殖过程中的大量使用及滥用现象，动物源性耐药严重威胁了畜禽健康，而新型的抗生素耐药基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）和耐药细菌（Antibiotic resistance bacteria，ARB）也不断被发现并广泛的在不同宿主间传播，严重的威胁了人类的健康。近年来，有研究表明噬菌体可以作为耐药基因的储存库并促进耐药基因在环境中的水平传播，表明噬菌体通过转导作用在不同细菌中进行耐药基因的交流可能比预想的更加频繁。因此，明确养殖环境中噬菌体携带耐药基因的流行分布情况及传播规律，对于后期深入研究其传播机制及控制其传播意义重大。　　本文选择了一个广东惠州地区的猪场，分别采集猪粪便、猪场内蔬菜地土壤和污水处理池中污水样品，进行细菌及噬菌体宏基因组提取后，首先采用普通PCR法（Polymerase chain reaction）对8大类32种常见耐药基因：磺胺类耐药基因（sul1， sul2，sul3）、大环内酯类耐药基因（ermA，ermB，ermF，mefA，vatB，mphA，ereB）、粘菌素耐药基因mcr-1、喹诺酮类耐药基因（qnrA，qnrB，qnrS，oqxA，oqxB，aac(6')-Ib-cr， qepA）、β-内酰胺类耐药基因（blaTEM，blaSHV，blaCTX）、利奈唑胺耐药基因optrA、酰胺醇类耐药基因（cmlA，floR，fexA，cfr，fexB）和四环素类耐药基因（tetM，tetA， tetB，tetT，tetW）进行定性检测，然后对于检测阳性的耐药基因进行定量检测以明确噬菌体携带耐药基因的流行分布情况，最后计算转导值（TA，transduction ability value），初步评估不同耐药基因通过噬菌体在环境中水平传播的能力。　　32种耐药基因的检出率结果显示，粪便、污水和土壤噬菌体基因组中耐药基因检出率分别为34.38%（11/32）、37.50%（12/32）和15.63%（5/32），但是较低的检出率仍然不能掩盖一些重要耐药基因的传播特性，其中5种耐药基因sul1、blaTEM、ermB、floR和tetM基因在所有样品噬菌体基因组中均被检测出且仅在土壤样品检出率较低，结果表明噬菌体在这5种耐药基因的水平传播中，特别是从粪便到污水过程可能起了重要作用。进一步定量结果显示（为了更精确反映真实样品环境，单一耐药基因在所有样品中低于50%检出率则不进行定量分析）：细菌基因组在粪便中的ermB基因丰度最高，污水中则为floR最高；在噬菌体基因组中，粪便样品ermB基因丰度仍表现为最高，而在污水中则为blaTEM基因。　　为了进一步探究噬菌体转导传播耐药基因的能力，TA值的引入可以初步评估噬菌体和细菌之间的基因交流能力。因此，计算耐药基因在噬菌体中的绝对丰度与细菌中绝对丰度的比值可以测定噬菌体携带不同ARGs进行传播的能力。通过TA值的计算，结果表明qnrA基因TA值为最高，达10-1数量级（即细菌中每10个基因则有1个会通过噬菌体介导传播），而其在细菌及噬菌体DNA中的丰度和检出率仅处于中游水平。结果表明：虽然有些耐药基因的丰度及检出率较低，但仍然且有着较强的传播能力，我们不应该低估其通过噬菌体转导作用而介导的水平传播。由此说明：在未来评估不同耐药基因通过噬菌体转导作用水平传播的研究中，不应仅仅只关注耐药基因检出率及在噬菌体基因组的绝对丰度，TA值同样应该纳入评估体系中。

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1 引言

1.1 环境中抗生素和抗生素耐性基因

1.1.2 抗生素耐药基因的来源和传播

1.1.3 抗生素耐药基因在养殖环境中的流行现状

1.2 噬菌体

1.2.1 噬菌体的概述

1.2.2 环境中噬菌体携带耐药基因传播的研究概况

1.3 研究目的与意义

2.1 实验材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 主要溶液的配制

2.2 方法

2.2.1 粪便、菜地土壤、污水样品采集

2.2.2样品前处理

2.2.3 菌群DNA的提取

2.2.4 噬菌体DNA的提取（Thurber et al., 2009）

2.2.5 普通PCR法检测耐药基因

2.2.6 荧光定量PCR检测耐药基因丰度

2.2.7 数据分析

3. 结果与分析

3.1 荧光定量PCR检测耐药基因含量

3.1.1 阳性质粒测序结果

3.1.2 ARGs质粒浓度及拷贝数

3.1.3 ARGs荧光定量标准曲线及特异性验证

3.2普通PCR法检测样品常见耐药基因的检测率

3.2.1粪便中常见耐药基因的检测率

3.2.2 污水系统中常见耐药基因的检测率

3.2.3 菜地土壤中常见耐药基因的检测率

3.3 qPCR法检测样品中耐药基因的丰度

3.3.1 粪便中细菌及噬菌体中耐药基因丰度定量

3.3.2 污水处理系统中细菌及噬菌体中耐药基因丰度定量

3.4 噬菌体转导能力评估

3.4.1 粪便中噬菌体转导能力评估

3.4.2 污水处理系统中噬菌体转导能力评估

4 讨论

4.1 粪便、污水和菜地土壤中耐药基因检出率分析

4.2 粪便和污水基因丰度检测

4.3 粪便和污水TA值

4.4 整体评估噬菌体转导耐药基因传播的能力

5 全文总结

致 谢

参考文献

附录：