PB2 E627K和D701N氨基酸替换对H3N2亚型犬流感病毒致病性的影响

摘要

犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）是能引起犬只发热、喷嚏、咳嗽、流鼻涕及食欲不振等临床症状的A型流感病毒。长期以来，犬被认为不感染流感病毒，自2004年美国弗罗里达州发生CIV致死犬只的报道后，才引起了人们对CIV的关注，我国于2010初次分离到CIV H3N2。CIV H3N2为低致病性流感病毒，进化树分析发现其来源于禽源H3N2流感病毒，该病毒经长年的遗传进化已适应了犬只，并能在犬群中稳定传播。当今，随着人类生活质量的提高，犬作为伴侣动物的数量日益增多，人类与犬的接触也越趋频繁，CIV已成为影响人类公共卫生健康的潜在威胁，所以对CIV的研究具有重要意义。　　自然界中流感病毒的进化基础是发生基因的突变和重组，而基因突变更是频频发生。研究已经表明，A型流感病毒PB2蛋白中存在多个关键性的氨基酸位点对病毒在哺乳动物中的复制能力或致病性起重要作用。当中，以E627K和D701N氨基酸的位点突变研究最多，其影响作用最为确实。　　本研究为了探究PB2的E627K和D701N氨基酸替换对CIV H3N2致病性的影响，利用定点突变技术针对本实验室保存的A/canine/Guangdong/02/2011（C/GD/02）反向遗传系统中的pHW2000-PB2质粒进行位点突变，经反向遗传技术获得四株拯救毒株：PB2 E627K突变毒株rC/GD/02-627K、PB2 D701N突变毒株rC/GD/02-701N、PB2 E627K/D701N双位点突变毒株rC/GD/02-627K/701N和拯救原毒株rC/GD/02。生物学特性结果显示：原毒株HA效价要比突变毒株的高一个效价；三株突变毒株的EID50和TCID50均略高于rC/GD/02毒株的；在MDCK细胞中的生长曲线显示各突变株复制能力均略微下降。聚合酶活性检测结果显示：突变毒株聚合酶活性均显著增强（P＜0.05），其中PB2 627K/701N突变导致的聚合酶活性增加最为明显（P＜0.01）。小鼠攻毒感染试验显示：各拯救毒株均能对小鼠肺脏和气管产生一定程度的组织损伤，但各毒株均未导致小鼠死亡，各毒株对小鼠体重的影响无显著差异，该结果表明PB2 E627K和D701N位点突变均未增强CIV H3N2对小鼠的致病性。比格犬攻毒感染试验显示：各拯救毒株均未引起比格犬明显的体温升高，但均能引发犬肺炎产生，肺脏出现充血、出血并产生局部病灶；各毒株均能对犬肺脏、气管和鼻甲骨产生不同程度的病理组织损伤，并能检测到CIV的存在。各毒株均能引起犬只连续九到十天的呼吸道排毒，rC/GD/02-627K和rC/GD/02-701N毒株还出现间歇性的肛门排毒，同时，各毒株均能在感染后第五天开始产生中和抗体，抗体能在血液中持续存在约一百天。但各拯救毒株间并未对比格犬产生显著的致病性差异，因此，PB2 E627K和D701N位点突变均未增强CIV H3N2对比格犬的致病性。　　综上所述，本研究拯救了CIV PB2 E627K、D701N、E627K/D701N突变的毒株，比较了它们与原毒株的生物学特性及病毒聚合酶活性，分别感染的小鼠和比格犬发现，CIV H3N2的PB2 E627K和D701N的氨基酸替换，对该病毒的致病无显著影响性。本试验为CIV H3N2的防控工作提供数据依据，为CIV致病性的研究提供参考和方法。

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1 前言

1.1 研究背景

1.1.1 流感病毒结构

1.1.2 流感病毒编码的主要蛋白功能

1.1.3 犬流感病毒概述

1.1.4 反向遗传技术在流感病毒中的应用

1.1.5 流感病毒PB2蛋白627和701位点的研究

1.2 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 毒株

2.1.2 质粒

2.1.3 细胞

2.1.4 试验动物

2.1.5 主要试剂

2.1.6 相关试剂配制

2.1.7 仪器设备

2.1.8 生物学软件

2.2 方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 定点突变

2.2.3 质粒提取

2.2.4 拯救突变毒株

2.2.5 病毒生物学特性检测

2.2.6 流感聚合酶活性检测

2.2.7 病毒对小鼠的致病性

2.2.8 病毒对比格犬的致病性

2.2.9 统计学分析

3 结果

3.1 拯救毒株序列鉴定

3.2 病毒生物学特性

3.2.1 病毒感染MDCK细胞

3.2.2 病毒HA血凝效价、EID50、TCID50

3.2.3 病毒生长曲线

3.3 流感病毒聚合酶活性

3.4 拯救毒株对BALB/c小鼠致病性的影响

3.4.1小鼠感染病毒后体重变化

3.4.2 小鼠脏器病毒滴度

3.4.3 小鼠肺脏和气管的HE染色

3.4.4 小鼠肺脏和气管的IHC

3.5 拯救毒株对比格犬致病性的影响

3.5.1 比格犬感染病毒后体温变化

3.5.2 比格犬肺部X线检查

3.5.3 比格犬肺脏离体观察

3.5.4 比格犬脏器组织病毒滴度

3.5.5 比格犬肺脏、气管及鼻甲骨HE染色

3.5.6 比格犬肺脏、气管及鼻甲骨IHC

3.5.7 比格犬鼻拭子、肛拭子EID50

3.5.8 比格犬血清中抗体效价

4 讨论

4.1 流感聚合酶活性对其复制能力的影响

4.2 突变毒株对哺乳动物致病性影响

4.3犬中病毒排出及血清抗体生成

5 结论

致 谢

参考文献

附录