菌根诱导的三个大花蕙兰SWEET基因的功能初步分析

摘要

兰科植物菌根 (OM）在结构上虽然是典型的内生菌根类型，但其营养机理长期被认为是植物寄生于真菌。近年来，Cameron等（2006）利用放射性同位素标记实验表明，绿色兰科植物成株与菌根菌（OMF）之间确实存在互惠共生关系，即菌根真菌协助植物在陆地环境固着并为植物提供矿质营养，而宿主提供碳水化合物回馈给真菌。但宿主的碳水化合物是如何被转运至共生真菌？这种转运过程又是如何被调控？宿主糖转运蛋白基因的克隆、定位及其表达调控机制的研究将为建构绿色兰科植物 OM 互惠共生机制提供坚实证据。同时，这也将为实现兰花珍贵品种的保育和栽培建立重要的技术基础。　　本实验小组前期证明大花蕙兰（Cymbidium hybridum）能与印度梨形孢（Piriformospora indica）在DE培养基中形成菌根共生结构，并且在菌根形成过程中，糖转运蛋白CySWEET14、CySWEET4a和CySWEET4b受菌根真菌诱导上调表达。本论文将 CySWEETs 在拟南芥中进行异源表达，以期验证其糖转运活性并初步探讨植物SWEET家族在植物共生过程中的可能功能。本论文主要研究结果如下：　　（1）通过调节氮形态、碳源、磷浓度来筛选适合印度梨形孢与大花蕙兰、拟南芥均能形成有益共生的培养基。实验结果表明，在硝态氮和铵态氮比例为1∶2，总无机氮量为9 mM，磷浓度为5 mM，添加0.25 g/L酵母和5 mM可溶性淀粉的LW01c培养基中，印度梨形孢可以与两种宿主形成共生结构，并促进植物生长。　　（2）以LW01为基础，比较培养基中碳源添加对大花蕙兰与印度梨形孢共生的影响。结果表明，添加蔗糖和可溶性淀粉都有利于真菌的定殖，但在添加蔗糖的LW01 培养基中，印度梨形孢对大花蕙兰的生长起抑制作用，根系畸形负向地性生长，培养基中的根系褐化严重；而无碳源的LW01 培养基中，印度梨形孢几乎不能在大花蕙兰根系皮层中定殖。　　（3) RT-qPCR 试验结果表明，在 LWSt 培养基中，CySWEET14、CySWEE4a和CySWEET4b在大花蕙兰形成菌根进程中呈现诱导表达模式。　　（4）CySWEET4a 超表达和 CySWEET4b 回复突变植株在低浓度葡萄糖（5 mM）处理时生长表现优于WT，而50 mM葡萄糖处理时根系生长受抑制，叶色变黄，暗示CySWEET4a具有较高的糖转运活性；在添加5 mM蔗糖处理时观察CySWEET14 异源回复 atsweet11;12 植株回复效果明显，可改善生长迟缓的缺陷，表明CySWEET14具有糖转运功能。　　（5）在LW01共生培养基中，接菌处理（7 dpi、14 dpi）导致拟南芥根系中的AtSWEET11和AtSWEET12下调表达；而印度梨形孢促进atsweet11;12根系鲜重增加的共生效应显著高于野生型，这说明，AtSWEET11和AtSWEET12负调控拟南芥与印度梨形孢的共生过程。因而，CySWEET14 在拟南芥中的同源基因AtSWEET11和AtSWEET12在植物与印度梨形孢共生过程中执行的功能不同。　　（6）获得CySWEET14和CySWEET4a回复双突变体atsweet11;12的T3代株系。印度梨形孢促进这些株系根系鲜重增加的共生效应优于野生型，但弱于双突变体，体现出功能部分回复的中间类型。

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