提高大肠杆菌碱性磷酸酶活性的纳米酶构建

摘要

铁蛋白（ferritin）在动植物和微生物中作为储存游离铁的形式而广泛存在，并发挥着重要的功能。由于铁蛋白具有良好的热稳定性、化学稳定性以及特殊的球状纳米结构，目前已经广泛应用于生物传感器、疫苗的开发等研究和应用。重组人铁蛋白重链（recombinant heavy chain of human ferritin，rHF）具有在体外自组装形成二十四聚体笼形纳米颗粒的特性。形成二十四聚体后，rHF的C端包裹在空腔内，而N端暴露在铁蛋白的空腔外部，这种结构为我们对铁蛋白蛋白壳的后续修饰与蛋白质融合提供了有利条件。rHF作为天然生物纳米材料，其元件相对简单，修饰和组装技术也比较成熟，可以通过基因工程手段在rHF的纳米笼外壳展示功能性蛋白，该定向高集聚方式可能对蛋白的功能具有较高的强化作用，具有重要的实际意义。大肠杆菌碱性磷酸酶（Escherichiacolialkaline phosphatase，EAP）以其自身的特性，被经常用作研究碱性磷酸酶的模型，目前对于大肠杆菌碱性磷酸酶的研究已经比较完备，晶体结构以及关键残基的功能也多有报道。大肠杆菌碱性磷酸酶的活性与牛小肠碱性磷酸酶相比，活性低下，但是生产便捷，成本很低。获得与牛小肠碱性磷酸酶相当活性的大肠杆菌碱性磷酸酶是工业界一直努力的目标，虽然通过点突变的方法在一定程度上可以提高EAP的活性，但是还远远不能够满足当前飞速发展的高灵敏检测技术的需求。　　本实验室根据前期甲基对硫磷水解酶和西塔列汀前体转氨酶 ATA-117 的研究基础，提出了生物基质纳米酶的概念，在本研究中，我们主要评价大肠杆菌碱性磷酸酶与铁蛋白融合后的特性，以期明确生物基质纳米酶的可行性和有效性，并有望获得一种能够明显提高酶催化活力的生物方法。我们以大肠杆菌ATCC 25922的碱性磷酸酶为研究对象，获得 EAP 的基因后，在已有研究报道的基础上，进行点突变，获得突变基因EAP(D101S)和EAP(D101S/K167R/S374C)，并将这些基因融合在rHF的N端，构 建 融 合 表 达 载 体 pET28a-EAP-rHF 、 pET28a-EAP(D101S)-rHF 和pET28a-EAP(D101S/K167R/S374C)-rHF。将这些载体在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS系统中进行大量表达，蛋白经过分离纯化之后，对纳米蛋白的物理化学特性进行深入的研究。研究结果发现EAP和其突变蛋白融合在rHF的N端之后不影响rHF的自组装特性，在经透射电子显微镜观察纯化得到的蛋白时，可以看到 EAP-rHF、EAP(D101S)-rHF 和 EAP(D101S/K167R/S374C)-rHF 都可以形成均匀对称的空腔球状结构，并且它们与EAP一样具有催化碱性磷酸酶底物对硝基苯磷酸二钠（PNPP）的酶学特性。对EAP及其突变体的纳米酶以PNPP作为催化底物的酶动力学结果分析发现：EAP-rHF的Kcat比EAP提高19倍左右；EAP(D101S)-rHF的Kcat比EAP(D101S)的提高26倍左右；EAP(D101S/K167R/S374C)-rHF的Kcat比EAP(D101S/K167R/S374C)提高7倍左右。由理化因素对EAP的纳米酶的酶活影响研究发现：EAP的纳米酶对于温度和pH有更高的耐受性，但没有改变EAP的最适pH；在相同浓度EDTA的处理条件下，纳米酶比游离酶显现出更强的稳定性。　　本实验在利用纳米铁蛋白作为承载基质去增强大肠杆菌碱性磷酸酶活性的基础上，还通过改变 EAP 与铁蛋白之间的空间距离去研究 EAP 酶活的变化。我们以EAP-rHF和EAP(D101S/K167R/S374C)-rHF为研究对象，通过延长基因之间的连接肽去改变两者的空间距离，我们选择三种不同长度的连接肽，即一个重复的 GGGGS、三个重复的GGGGS和五个重复的GGGGS。实验结果还表明，对于EAP-rHF，随着连接肽长度的增加， EAP-rHF 的酶活呈增加趋势；随着连接肽长度的增加， EAP(D101S/K167R/S374C)-rHF的酶活呈降低趋势。

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