大豆根瘤缺磷响应基因的表达谱及GmSPX5调控根瘤生长的研究

摘要

大豆是我国重要的粮食和油料作物。作为典型的豆科作物，大豆能与土壤中的根瘤菌共生形成根瘤，直接将大气中的氮气还原为氨，供给植物生长必需的氮源，对于农业生产以及环境保护具有非常重要的作用。磷不仅是植物细胞基础物质如核酸、蛋白质等的重要组成元素，而且参与了能量转化和酶活性调节等重要生命过程。所以，磷是植物生长和发育所必需的大量营养元素。然而，由于磷肥自身的理化性质，很容易被土壤吸附固定，导致土壤磷有效性较低。以往的研究表明，在缺磷胁迫下，豆科作物根瘤能够形成一系列的生理和分子适应性机制。但是，在全基因组水平全面解析大豆根瘤响应缺磷胁迫的差异表达基因，以及控制大豆根瘤适应缺磷胁迫的重要调控因子鲜有报道。本研究以大豆根瘤为主要研究对象，首先研究了大豆根瘤适应缺磷胁迫的部分生理机制。然后，在全基因组水平比较了大豆根瘤响应缺磷胁迫的基因表达谱。最后，以在根瘤缺磷上调表达的GmSPX5为研究对象，深入研究了其调控根瘤适应缺磷胁迫的分子机制。主要的研究结果如下：　　（1）缺磷胁迫显著影响大豆的生长及其根瘤固氮能力，主要表现为缺磷条件下根瘤变小、生物量减少以及固氮酶活性降低。虽然，缺磷处理下根瘤磷浓度明显降低，但是降低的幅度明显小于叶部和根部，说明根瘤具有较强的维持磷平衡的能力。而且，缺磷胁迫增加了根瘤的总氨基酸浓度，尤其是天冬酰胺的浓度，其浓度增加了36%；缺磷胁迫也显著增加了根瘤的酸性磷酸酶活性，主要表现在不仅增强了原有酸性磷酸酶同工酶的活性，而且诱导产生了新的酸性磷酸酶同工酶。　　（2）通过 RNA-seq 转录组测序技术，比较分析了正常供磷和缺磷处理下大豆根瘤的基因表达谱。结果表明，在大豆根瘤中鉴定到2,989个缺磷响应的差异表达基因，包括1,914个缺磷上调表达基因和1,075个缺磷下调表达基因。差异表达基因的功能主要参与了养分的转运、转录调控、代谢途径等生物学过程。其中，有29个缺磷响应基因的功能可能参与调控了大豆根瘤磷平衡，即9个高亲和磷转运子基因、12个紫色酸性磷酸酶基因和8个SPX基因。　　（3）以在根瘤受缺磷上调表达的 GmSPX5 为候选基因，通过结合定量 qRT-PCR和PGmSPX5:GUS大豆整株转基因植株的GUS活性染色，对GmSPX5的表达模式进行了分析。结果表明缺磷胁迫15天，GmSPX5在根瘤的表达量显著提高。而且，GmSPX5的表达主要集中在成熟大豆根瘤固氮区的侵染细胞中。通过烟草叶片亚细胞定位分析，明确了GmSPX5在细胞核和细胞质共定位。　　（4）通过酵母双杂交系统，鉴定了 GmSPX5 的互作蛋白。首先，在初步分析大豆基因组35个GmPHR成员的同源性、表达模式及其GmPHR25控制大豆磷平衡的基础上，以 GmPHR25 以及其它四个与拟南芥 AtPHR1 最同源的 4 个 GmPHR 成员（GmPHR9、17、22和32）为对象，研究了它们与GmSPX5的互作关系。结果表明GmSPX5与4个大豆GmPHR成员不存在互作。同时，以GmSPX5为诱饵蛋白对低磷胁迫下的大豆全长cDNA文库进行了筛选，获得了8个与GmSPX5互作的蛋白，其中包括两个转录因子类蛋白，GmNF-YC4和GmJAZ。　　（5）通过大豆整株转化法，获得了超量和干涉表达GmSPX5的大豆转基因株系，分析了GmSPX5超量和抑制表达对大豆根瘤生长及其表达谱的影响。结果表明，在正常供磷条件下，超量表达GmSPX5显著增加了根瘤数目及其内部侵染细胞的密度，提高了植株氮、磷含量和生物量。而且，田间试验结果表明，超量表达GmSPX5显著增加了大豆的籽粒数目和籽粒干重。在此基础上，进一步通过转录组测序，分析了超量表达GmSPX5对大豆根瘤基因表达谱的影响，结果表明，超量表达GmSPX5上调了根瘤131个基因的表达，其中有多个基因涉及到天冬酰胺的合成以及脂的转运，暗示了GmSPX5 可能通过调控根瘤天冬酰胺的合成和代谢，以及影响根瘤类菌体膜脂的转运来影响根瘤的生长和发育。　　综上所述，本研究通过RNA-seq测序技术在全基因组水平分析了大豆根瘤缺磷响应基因，揭示了大豆根瘤适应缺磷胁迫的分子调控机制的复杂性。进一步以缺磷显著上调表达的 GmSPX5 为候选基因，通过对大豆整株转基因株系的功能分析，揭示了GmSPX5 可能通过调控根瘤天冬酰胺的合成以及类菌体膜脂的转运，影响根瘤的生长和发育的分子机理，本研究结果为大豆氮磷协同高效的遗传改良提供了理论依据、候选基因和转基因大豆新材料。

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第一章 文献综述

1.1 大豆及其共生固氮的重要性

1.2 磷对植物及根瘤生长的重要性

1.3 植物适应缺磷的生理和分子机制

1.4 根瘤适应缺磷的生理和分子机制

1.5 植物SPX蛋白研究进展

1.5.1 植物SPX亚家族基因研究进展

1.5.2 植物其它SPX亚家族的研究进展

1.6 本研究的目的与意义

1.7 技术路线

第二章 磷有效性对大豆及根瘤生长的影响

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.2 营养液水培试验

2.2.3 生物量的测定

2.2.4 根瘤大小

2.2.5 总磷含量的测定

2.2.6 可溶性磷浓度的测定

2.2.7 酸性磷酸酶活性的测定

2.2.8 酸性磷酸酶同工酶谱分析

2.2.9 根瘤固氮酶活性的测定

2.2.10 根瘤游离氨基酸浓度的测定

2.2.11 数据统计及分析

2.3 结果与分析

2.3.1 缺磷对大豆根瘤生长的影响

2.3.2 缺磷对大豆及根瘤磷含量和磷浓度的影响

2.3.3 缺磷对大豆及根瘤酸性磷酸酶活性的影响

2.3.4 缺磷对大豆酸性磷酸酶同工酶谱的影响

2.3.5 缺磷对大豆根瘤氨基酸浓度的影响

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 缺磷对大豆根瘤基因表达谱的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 供试材料

3.2.2 测序样品的准备

3.2.3 样品总RNA的提取

3.2.4 cDNA文库的构建及RNA-seq测序

3.2.5 数据过滤和组装

3.2.6 参考序列比对

3.2.7 基因表达水平与差异表达基因

3.2.8 差异表达基因分析

3.2.9 实时荧光定量PCR

3.2.10 数据统计及分析

3.3 结果分析

3.3.1 正常磷及缺磷处理下根瘤差异表达基因统计

3.3.2 不同磷浓度处理下根瘤差异表达基因GO分析

3.3.3 差异表达基因的MapMan分析

3.3.4 磷平衡相关差异表达基因分析

3.3.5 编码转运蛋白的差异表达基因分析

3.3.6 差异表达基因中编码转录因子类的基因分析

3.3.7 差异表达基因中编码植物激素类的基因分析

3.3.8 差异表达基因中参与氨基酸代谢的基因分析

3.3.9 差异表达基因qRT-PCR验证

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 GmSPX5互作蛋白分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.4 进化树分析

4.2.5 表达模式分析

4.2.6 样品总RNA的提取及实时荧光定量PCR

4.2.7 亚细胞定位分析

4.2.8 大豆复合植株干涉GmPHR25功能分析实验

4.2.9 酵母转化实验

4.2.10 GmPHR25转录激活活性分析实验

4.2.11 GmPHR25的DNA结合活性分析实验

4.2.12 GmPHRs与GmSPX5互作分析实验

4.2.13 酵母杂交文库的构建及筛库实验

4.2.14 数据统计及分析

4.3 结果与分析

4.3.1 大豆GmPHR家族成员鉴定

4.3.2 GmPHR家族成员对缺磷的响应

4.3.3 GmPHR25功能分析

4.3.4 GmPHR25及其它成员与GmSPX5互作分析

4.3.5 通过大豆酵母杂交cDNA文库筛选GmSPX5互作蛋白

4.3.6 GmSPX5与候选蛋白的互作验证

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 GmSPX5基因功能分析

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 供试材料

5.2.2 序列比对及进化树分析

5.2.3 GmSPX5表达模式分析试验

5.2.4 烟草叶片瞬时表达亚细胞定位试验

5.2.5 大豆整株转化试验

5.2.6 GmSPX5启动子组织定位分析

5.2.7 超量或干涉GmSPX5转基因植株功能分析水培试验

5.2.8 超量表达GmSPX5对大豆产量的影响田间试验

5.2.9 根瘤侵染细胞甲苯胺蓝染色

5.2.10 超量表达GmSPX5对根瘤基因表达谱的影响

5.2.11 数据统计及分析

5.3 结果与分析

5.3.1 植物SPX蛋白进化树分析

5.3.2 GmSPX5在大豆不同组织部位的表达模式分析

5.3.3 GmSPX5在大豆根瘤不同生长时期的表达模式分析

5.3.4 GmSPX5在根和根瘤对缺磷的响应

5.3.5 GmSPX5亚细胞定位分析

5.3.6 GmSPX5转基因材料的获得

5.3.7 GmSPX5启动子驱动GUS的组织化学定位染色分析

5.3.8 超量或干涉表达GmSPX5对大豆根瘤生长的影响

5.3.9 超量表达GmSPX5影响大豆根瘤侵染细胞密度

5.3.10 超量表达GmSPX5对大豆产量的影响

5.3.11 RNA-seq分析WT和OX12株系根瘤基因表达谱的变化

5.3.12 WT和OX12株系根瘤差异表达基因分析

5.3.13 测序结果qRT-PCR验证

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 综合讨论

6.1 大豆根瘤适应缺磷胁迫的生理和分子机制

6.2 大豆GmSPX5调控根瘤生长的生理和分子机制

第七章 创新点、结论与研究展望

7.1 创新点

7.2 主要结论

7.3 研究展望

致 谢

参 考 文 献

附 录

攻读博士学位期间发表学术论文情况