大肠杆菌O157:H7新分子伴侣的预测、表达、纯化及其相互作用蛋白的初步筛选

摘要

EHEC O157:H7是一种重要的危害严重的肠道致病菌,它主要通过III型分泌系统(type III secretion system,TTSS)将毒力蛋白直接注入宿主细胞发挥致病作用,是许多革兰氏阴性致病菌中存在的复杂的分子装置。TTSS分子伴侣是TTSS的组成部分,对底物(效应蛋白或转位蛋白)分泌非常重要。目前在EHEC O157:H7中鉴定的效应蛋白与其它病原菌相比少了很多,而且已知效应蛋白的作用也无法解释EHEC O157:H7所导致的复杂的病理反应。
　　为深入探讨EHEC O157:H7的致病机制,我们从所有病原菌基因数据库中提取有关TTSS序列数据,进行同源分析、模体分析以及基因定位分析,预测出2个EHEC O157:H7可能的新分子伴侣(编码基因ecs4553,ecs4563),并对其三级结构进行预测分析,结果表明其二级结构均以α螺旋为主,符合TTSS分子伴侣的共同特征并进一步展开实验验证预测结果可靠性。
　　利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出新预测分子伴侣基因ecs4553,并构建在表达载体pET-28a(+)、pET-24a(+)上,在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,成功实现了融合蛋白His6-Ecs4553-His6,Ecs4553-His6,His6-Ecs4553的高效表达。His6-Ecs4553通过Ni2+亲和层析柱纯化;Ecs4553-His6以包涵体形式表达,重组表达蛋白经纯化,复性后获得了纯度为93.5％的目的蛋白;免疫新西兰大耳白兔制备了抗Ecs4553-His6的多克隆抗体,抗血清的ELISA效价达1:409,600,产生的抗体具有良好的免疫反应性,能够特异性识别基因工程表达的Ecs4553-His6蛋白。
　　PCR扩增了新预测分子伴侣基因ecs4563,并构建在表达载体pET-28a(+)、pET-24a(+)上,重组载体转化至E.coli BL21(DE3)中IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,成功实现了融合蛋白His6-Ecs4563-His6,Ecs4563-His6,His6-Ecs4563的高效表达。His6-Ecs4563主要以可溶形式表达,采用Ni2+亲和层析纯化,获得纯度大于90％的目的蛋白;Ecs4563-His6以可溶形式表达,通过Ni2+亲和层析纯化,并制备了多克隆抗体，Western blot检测抗体具有良好的免疫反应性,Ecs4563-His6的兔抗血清的免疫扩散效价为1:64。
　　我们用pull down的方法从EHEC O157:H7全菌蛋白中筛选到了与Ecs4563-His6及His6-Ecs4563相互作用的蛋白质,为ecs4200基因编码的FKBP型肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(旋转异构酶)和ecs4208基因编码的cAMP-调控蛋白。
　　本研究克隆表达并纯化了新预测分子伴侣Ecs4553,Ecs4563,并初步筛选到了Ecs4563的相互作用蛋白,为下一步研究蛋白功能,阐明TTSS的分泌机制,进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础。

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引 言

1. 肠出血性大肠杆菌O157:H7致病机制研究

2 III型分泌系统

3 III型分泌系统分子伴侣

4 EHEC O157:H7中TTSS分子伴侣的研究

第一章 EHEC O157:H7 TTSS新分子伴侣及其三级结构的预测

第一节 EHEC O157:H7中TTSS分子伴侣的预测

第二节 新分子伴侣结构的预测

第二章 肠出血性大肠杆菌O157:H7预测新分子伴侣Ecs4553的重组表达及纯化

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三章 肠出血性大肠杆菌O157:H7预测新分子伴侣Ecs4563的重组表达及纯化

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第四章 与Ecs4563相互作用蛋白的初筛

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第五章 兔抗Ecs4553-His6/Ecs4563-His6多克隆抗体的制备及检测

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第六章 全文总结

1本研究主要获得的结果

2本研究的创新之处

3需进一步研究的问题

参考文献

附图

致谢

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