颗粒裂解肽G13结构域的克隆表达和蛋白质结构比对

摘要

抗菌肽是由6-100个氨基酸组成的有杀菌作用的小肽,至今尚未发现细菌对其有抗药性,因此有极大的应用价值。目前药物多肽主要通过化学合成和基因工程生产,其中基因工程方法获得的成本较低,同时也为设计更利于临床应用的抗菌肽提供实验依据。基于抗菌肽数据库,利用序列和结构比对方法,可以为设计产生新的有较强活性的抗菌肽打下理论基础。
　　颗粒裂解肽Granulysin是由两个二硫键连接五个螺旋片段组成的抗菌肽,存在于细胞毒性淋巴细胞CTL和天然杀伤细胞NK内的颗粒中,具有广谱抗菌活性;其G13结构域是由19个氨基酸残基组成的一个α螺旋和loop结构,对颗粒裂解肽的活性较为重要,可抑制细菌、真菌的活性,但对动物细胞和脂质体没有影响,因此具有重要的理论和应用研究价值。本实验室在前期研究中构建表达了颗粒裂解肽G13结构域,但表达量只为3％;本文为了提高蛋白表达量,在宿主菌大肠杆菌Top10中改用融合表达,根据大肠杆菌表达偏好密码子,将G13结构域多肽序列反翻译为核酸序列;采用化学合成核酸序列,PCR扩增后的产物用T-A克隆法与pBAD/TOPO ThioFusion表达载体连接,转化“感受态”大肠杆菌Top10,构建基因工程菌,对目的蛋白进行表达;用SDS-PAGE检测表达结果表明表达量达到67％,这为探索一种新的低成本生产抗菌肽的方法提供了参考。
　　应用PredictProtein预测方法(www.predictprotein.org)对表达的蛋白质序列(QRSVSNAATRVCRTGRSRW)进行二级结构特征分析,发现目的蛋白序列在融合蛋白中原有的α螺旋活性结构没有改变,目的蛋白仍然保持原有的活性结构。这进一步说明用基因工程的方法得到高产量的抗菌肽切实可行。
　　根据已发现的大量抗菌肽的分子结构,通过分析比较抗菌肽分子的蛋白质一级结构和空间构象的关系,可以设计具有高活性的新型抗菌肽分子序列。为了从抗菌肽的数据库中尽快找到活性强的抗菌肽,需要较快的蛋白质结构比对算法。本文提出了新的基于三维结构不变量(如主链连续四个碳原子的体积)的蛋白质结构比对算法。通过将三维结构数据转换为数值的比较得到最优的两序列比对,这极大地降低计算量。与一些著名的结构比对软件(如Dali，STRUCTAL，CE和SSM等)的仿真比较,本文的算法较好地权衡了“均方根偏差”(RMSD)和“匹配的残基个数”这两个互相矛盾的比对评价标准。

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第1章引 言

1.1.抗菌肽研究进展

1.2.颗粒裂解肽Granulysin

1.3.生物信息学

1.4.本文的主要内容、意义和创新点

第2章颗粒裂解肽G13结构域的克隆表达

2.1.实验背景及实验内容

2.2.材料

2.3.方法

2.4.结果

2.5.讨论

第3章蛋白质结构预测

3.1.材料与工具

3.2.结果与讨论

第4章蛋白质结构比对

4.1.算法描述

4.2.测试集

4.3.比对结果和分析

第5章总结与进一步工作

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文