HBx下调线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)来影响机体的先天性免疫

摘要

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)持续感染是诱发原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)产生的主要原因,X蛋白(HBx)在其中发挥了关键性作用。HBx基因是由乙型肝炎病毒基因组最小的开放读码框架(open reading fragment,ORF)编码的,全长465bp,编码154个氨基酸。线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondria antiviral signaling protein,MAVS)是2005年由四个不同的科研小组同时报道的一个在先天性免疫反应中起接头作用的蛋白,其通过自身的疏水跨膜结构域(transmembrane domain,TM)定位在线粒体外膜上,是线粒体中发现的第一个与先天性免疫相关的蛋白质。人类的MAVS基因位于20号染色体的短臂20P13,其cDNA全长为1620bp,编码一个具有540个氨基酸的蛋白质。MAVS在调节机体的先天性免疫反应中具有多种功能,它可以激活转录因子NF-κB和IRF-3,这些有活性的转录因子协同调控β干扰素基因的表达。
　　本课题通过免疫沉淀、免疫印记以及GST-Pull Down等方法发现了HBx和MAVS在细胞内和细胞外都存在相互作用,并且证明了MAVS是通过TM结构域和HBx73-154位氨基酸相互作用的,缺失TM结构域的MAVS或73-154位氨基酸的HBx彼此之间就不能再相互作用。利用荧光素酶报告基因实验检测HBV-DNA和HBx对N-RIG-I、PolydAT以及MAVS诱导的IFN-β-luc、NF-κB-luc和IRF-3-luc报告基因转录水平的影响,结果发现HBV-DNA和HBx可以抑制由N-RIG-I、PolydAT以及MAVS诱导引起的IFN-β-luc、NF-κB-luc和IRF3-luc报告基因转录水平的激活,并呈现剂量依赖性。通过对整个β干扰素信号通路的研究,我们发现HBx是以MAVS为作用靶点来影响β干扰素的产生;通过荧光定量PCR方法检测β干扰素的mRNA水平,结果发现HBx是在转录水平上影响β干扰素基因的表达。进一步研究证明,HBx可以影响内源MAVS蛋白的表达水平,并呈现剂量依赖性;HBx,一方面可以介导MAVS泛素化通过蛋白酶体途径降解;另一方面通过缩短MAVS在细胞内的半衰期来影响MAVS的稳定性。另外,在病毒感染的情况下,MAVS与其上游信号分子RIG-1的相互作用随着感染时间的增长逐渐增强,而当细胞内转染有HBX时,RIG-1和MAVS的相互结合随着感染时间的增长逐渐减弱。
　　本研究首次从HBx对MAVS功能和稳定性的角度出发,阐明了HBV持续性感染的可能性机制,为深入了解微生物感染后发生免疫逃逸的分子机理,抗病毒治疗药物的研发打下了基础。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩略词表

引言

第一部分：HBx与MAVS的研究背景

第二部分：先天性免疫反应的激活

第三部分：HBx调节MAVS功能的研究目的、方法与意义

材料与方法

1. 细胞株、菌株及质粒

2. 实验材料

3. MAVS 全长基因的获得

4. 载体构建、引物合成及测序

5．谷胱甘肽S 转移酶（glutathion S-transferase, GST）融合 蛋白的制备

6. 转染质粒的制备

7. 细胞计数

8. 细胞培养与转染

9. 荧光素酶报告基因实验

10. 免疫沉淀（ Immunoprecipitation,IP ） 与免疫印迹 （Immunoblot, IB）

11. 细胞中总RNA 的提取及RT-PCR

12. 免疫荧光

13. HBV 病毒表面抗原（HBsAg）检测

14. 线粒体分离

15.其它

结果

第一部分：HBV抑制RIG1-MAVS信号通路激活β干扰素的产生

第二部分：HBx以MAVS为靶点抑制RIG1-MAVS信号通路激活β干扰素的产生

第三部分：HBx抑制RIG1-MAVS信号传导途径的机制研究

讨论

结论

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文综述（第一署名）