中性粒细胞胞外网状陷阱在类风湿关节炎致病机制中的初步探究

摘要

目的：探究中性粒细胞胞外网状陷阱（Neutrophilextracellulartraps，NETs）对类风湿关节炎患者主要的效应细胞滑膜成纤维细胞（rheumatoidarthritisfibroblast-likesynoviocytes，RA-FLSs）和滑膜巨噬细胞的作用机制。　　方法：取RA患者滑膜组织分离培养滑膜成纤维细胞，进行免疫荧光染色鉴定；通过小鼠腹腔刺激实验获取并培养巨噬细胞；提取健康人外周血中性粒细胞，刺激NETs形成并提取NETs；用CellTiter96?AQueous单溶液试剂（MTS）增殖实验评估NETs对RA-FLSs增殖；NETs刺激RA-FLSs60h后，分别收集细胞上清液和细胞，ELISA检测细胞上清液中白细胞介素6（interlukin-6，IL-6）和白细胞介素25（interlukin-25，IL-25）的水平；收集的RA-FLSs提取总RNA，用定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）测定RA-FLSs中结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)mRNA的表达情况，收集RA-FLSs提取总蛋白，用蛋白质免疫印迹实验（westernblot，WB）检测哺乳动物不育系20样激酶1（mammaliansterile20-likekinase1,MST1）表达变化；将NETs刺激RA-FLS60h后收集的上清液加入巨噬细胞培养7d，瑞吉染色观察细胞形态变化。采用配对样本t检验和单因素方差分析对结果进行统计学处理。　　结果：1）分离纯化的中性粒细胞体外刺激可形成NETs，提取的NETs测定DNA浓度为58.5ng/ul（1×106细胞）；2）与对照组（0ulNETs）相比，NETs能促进RA-FLSs增殖，且随着NETs浓度增加其促进RA-FLSs增殖的能力也增强（F=99.519,P＜0.001）；3）与对照组（0ulNETs）相比，10ulNETs可以明显促进RA-FLSs增殖（t=-12.226，P＜0.01）；4）用DNaseⅠ预处理NETs后，其促进RA-FLSs增殖的作用受到抑制（t=-2.376，P=0.049）；5）NETs能刺激RA-FLSs内CTGFmRNA表达上调（30.696±0.468，t=12.13，P＜0.01）；6）与对照组相比，NETs能刺激RA-FLSs内MST1激酶表达显著下调（P＜0.01）；7）NETs刺激RA-FLSs60h后细胞上清液中IL-6和IL-25浓度高于对照组（P<0.05）；8）NETs刺激RA-FLSs60h后收集的上清液加入巨噬细胞培养7d后，巨噬细胞有一部分分化成了多核巨细胞，而用RA-FLSs上清液培养滑膜巨噬细胞7d后未发现有多核巨细胞生成。　　结论：NETs在体外能促进RA-FLSs增殖并刺激RA-FLSs内MST1激酶表达显著下调，CTGFmRNA表达上调，细胞上清液中IL-6、IL-25浓度高于对照组，提示NETs可能通过调控MST1激酶介导RA-FLSs增殖、产生CTGF及释放多种炎性细胞因子。NETs刺激RA-FLS60h后收集的上清液能诱导巨噬细胞分化成多核巨细胞。

目录

声明

第一章 前言

1.1 NETs的形成

1.2 NETs在RA中的研究进展

1.2.1 NETs是瓜氨酸化蛋白及细胞因子的来源，刺激机体产生ACPAs

1.2.2 RA抗体和炎性细胞因子诱导NETs产生并形成恶性循环

1.2.3 NETs 激活RA 的滑膜成纤维细胞

1.2.4 PADs酶催化NETs中蛋白瓜氨酸化

1.2.5 RA中NETs的清除异常

1.2.6 环境因素在RA中与NETs的关系

1.2.7 NETs在RA中的治疗进展

1.3 MST1激酶在自身免疫性疾病中的研究进展

1.3.1 MST1激酶概况

1.3.2 MST1激酶在RA等自身免疫性疾病中的研究进展

1.4 CTGF在RA中的研究进展

1.4.1 CTGF概况

1.4.2 CTGF在RA中的研究进展

1.5 IL-25在自身免疫性疾病中的研究进展

1.5.1 IL-25概况

1.5.2 IL-25在自身免疫性疾病中的研究进展

第二章 材料与方法

2.1 主要试剂、仪器

2.2 NETs刺激试验

2.2.1 外周血中性粒细胞（Neuprothil，N）提取，NETs刺激形成及提取纯化

2.2.2 细胞培养1) 实验对象

2.2.3 细胞支原体污染检测

2.2.4 MTS增殖实验

2.2.5 ELISA检测细胞上清液中IL-6、IL-25含量

2.2.6 NETs刺激RA-FLSs的上清液培养巨噬细胞

2.3 NETs刺激实验下游靶标检测

2.3.1 NETs刺激及提取

2.3.2 滑膜成纤维细胞的培养

2.3.3 NETs刺激RA-FLSs实验

2.3.4免疫印迹Western Blot（WB）检测RA-FLSs内MST1蛋白表达

2.3.5 RT-PCR检测RA-FLSs内CTGFmRNA表达

2.4 统计学处理

2.5 质量控制

2.5.1 研究基础

2.5.2 工作条件

2.5.3 数据分析

第三章 结果

3.1 NETs刺激试验

3.1.1 PMA诱导NETs形成

3.1.2 NETs浓度测定

3.1.3 RA-FLSs鉴定

3.1.4细胞支原体污染检测

3.1.5 NETs促进RA-FLSs增殖

3.1.6 NETs刺激RA-FLSs的上清液培养巨噬细胞

3.2 NETs刺激实验下游因子检测

3.2.1 NETs能促进RA-FLSs释放炎性细胞因子IL-6和IL-25

3.2.2 NETs刺激RA-FLSs内MST1表达下调

3.2.3NETs刺激RA-FLSs内CTGF mRNA的表达上调

第四章 讨论

第五章 结论

创新性及展望

参考文献

缩略词表

在学期间研究成果

综述:中性粒细胞胞外网状陷阱在类风湿性关节炎中的研究进展

参考文献