微针所致皮肤创伤愈合对透明质酸透皮能力的影响

摘要

目的：　　目前微针经皮给药技术的研究集中于促渗作用，忽略了该方法所致创伤的愈合过程。本研究旨在探讨微针所致皮肤创伤的愈合过程，同时研究其愈合过程对透明质酸经皮渗透能力的影响。　　方法：　　1、剃除SD大鼠背部毛发，观察皮肤出血情况；切取剃毛后全层皮肤修剪皮下组织，观察修剪前后皮肤层次；取全层皮肤、修剪皮下组织前后皮肤和微针针刺后皮肤行HE染色，组织学观察角质层完整性、修剪层次和针刺深度。　　2、用正交设计软件专业版V3.1设计实验，以针头型号G、透明质酸分子量Mr、透皮时间T作为考察因素，每个因素4个水平，即针头型号（无针头、25G、22G、18G）、透明质酸分子量（10kDa、100kDa、1000kDa、1500kDa）、透皮时间（1h、3h、5h、7h）。依据正交表L16(45)，获得16组实验组合。　　3、使用改良的Franz扩散池进行大鼠离体皮肤渗透实验。用大鼠透明质酸酶联免疫试剂盒（Rat HA ELISA KIT）测定每组实验样品液内的透明质酸浓度，以每组实验样品液的浓度减去相同透皮时间的空白对照组浓度作为考察指标，筛选和优化最佳实验组合“G-Mr-T”。　　4、取3只已备皮的大鼠麻醉后，于脊柱两侧对称部位画直径约1.5cm的圆圈，左右各三个，圆圈内分别使用22G微针阵列和18G微针阵列穿刺，照相、肉眼观察并记录皮肤反应及愈合情况。　　5、体内实验分组：18只已备皮的SD大鼠，体重约180g，创伤愈合组织学观察、钙黄绿素染色和HA经皮渗透分别随机抽取2只、6只和10只，腹腔注射水合氯醛（0.003mL·g-1）麻醉。按操作4进行标记，每2只大鼠的时间点设计如下：1只大鼠的左侧圆圈由头侧向尾侧分别设为0h、3h、6h，右侧为9h、12h、15h，另1只的左侧为18h、21h、24h，右侧为正常对照、空白对照；微针针刺后，无菌纱布覆盖，待其自然愈合，到每个时间点后，取开纱布，分别进行下列实验操作。　　6、钙黄绿素染色：用钙黄绿素棉球覆盖，避光染色10min，取开棉球，用盐水和酒精棉球交替擦拭各2遍，取全层皮肤稍微修剪皮下组织后置于载玻片， 立即在荧光显微镜下观察，激发波长490nm，发射波长515nm，统计光斑数，获取荧光图像。　　7、创伤愈合组织学观察：切取全层皮肤行HE染色，观察组织学变化。　　8、透明质酸体内经皮渗透：涂抹透明质酸4h，用PBS液湿棉签擦去表面滞留的HA，取下全层皮肤，清洗后将全层皮肤和皮下肉膜层分开，分别匀浆，采用Rat HA ELISA KIT测定透明质酸浓度。　　9、正交设计软件V3.1进行正交实验设计的数据分析。皮肤和肉膜中HA含量用x±s表示。采用统计学软件SPSS19.0进行统计学分析。多个实验组样本均数两两之间的比较用SNK-q检验（n=5），P<0.05为差异有显著性。多个样本率的比较用卡方分割法，为保证检验假设中I型错误a的概率不变（a=0.05），须重新规定检验水准a′（a′=a/2（k-1），其中a=0.05，k为实验组数），得出P<0.00313为差异有显著性。　　结果：　　1、脊柱两侧毛发剃除干净，未见伤痕及出血点，角质层、颗粒层、棘层、基底层及真皮层层次分明，角质层完好无损，皮肤屏障结构健全；修剪后皮肤未见肉眼可见皮下组织及破洞，皮下面完整光滑，完整保留真皮层；微针阵列针刺皮肤后，作用部位角质层破坏，刺入深度达真皮乳头层。　　2、HA体外透皮正交实验中，针头越粗、分子量越小、透皮时间越长，HA的透过量越多（P＜0.05）。“18G-10k-7h”、“18G-100k-5h”、“22G-10k-5h”、“22G-100k-7h”组合的透过量（ng·L-1）分别为410.555、231.700、294.705、215.440，考虑分子量越大，其降解速度越慢，效果越持久，分子量定为100kDa；当透皮时间在3～5h，其透皮速率最大，所以将透皮时间定为4h；而针头型号在22G或18G中选择，根据两者的愈合过程择优而定。　　3、肉眼观：22G微针针刺后15h基本愈合，而18G延迟到21h，两种针型到24h基本恢复正常皮肤形态。因此，最优体内实验组合确定为“22G-100k-4h”，选择22G微针进行在体钙黄绿素染色、创伤愈合组织学观察和透明质酸透皮实验。　　4、钙黄绿素染色：22G微针针刺皮肤，经过0h、3h、6h、9h、12h、15h的愈合过程后，行钙黄绿素染色10min立即观察，光斑个数小幅度减少，染色率分别为98.9％、97.8％、95.6％、94.4％、92.2％、91.1％，两两相比，染色率轻度下降（P＞0.00313）；经过18h、21h、24h的愈合过程后，光斑个数大幅度减少，染色率分别为3.3％、1.1％、2.2％，与0h相比，染色率大幅度降低（P＜0.00313）。随着愈合时间的延长，荧光光斑轮廓逐渐变小，15h时微弱可见，18h已无荧光光斑。　　5、创伤愈合组织学观察：22G微针针刺后皮肤屏障破坏，深达真皮乳头层，随着愈合时间的延长，微孔收缩，尺寸变小。到18h，微孔被增生的表皮细胞覆盖，皮肤屏障结构基本恢复。　　6、HA皮肤滞留量：正常对照组（无微针预处理的正常皮肤外用HA）皮肤HA含量与空白对照组（无微针预处理的正常皮肤外用PBS液）相同（P＞0.05）。22G微针针刺，分别经过0h、3h、6h、9h、12h、15h愈合后，再涂抹HA，皮肤内HA的含量均高于空白对照组（P＜0.05），且随着愈合时间点的增加，皮肤HA的含量减少（P＜0.01）；而经过18h、21h、24h的愈合时间后，再给予HA，皮肤内HA的含量与空白对照组相近（P＞0.05）。　　7、HA肉膜滞留量：22G针刺后分别经过0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h愈合后，再给予外用HA，肉膜层HA的含量与空白对照组相近（P＞0.05）。　　结论：　　1、微针所致皮肤创伤在24h内愈合，皮肤屏障功能恢复。　　2、22G微针针刺后HA（Mr=100kDa）的透皮量增加。随着微创伤的愈合，其透过量逐渐减少，18h后，创伤愈合，皮肤屏障功能恢复，HA无法经皮渗透。　　3、微针有助于大分子量（10kDa≤Mr≤1500kDa）HA透皮吸收。

目录

声明

第一章 前言

第二章 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

2.1.2 药品和试剂

2.1.3 试剂配制

2.1.4 实验动物

2.2 方法

2.2.1 透皮实验分析方法的建立

2.2.2 体外透皮渗透实验

2.2.3 体内透皮渗透实验

2.2.4 统计学处理

第三章 结果

3.1 透皮实验分析方法结果

3.2 皮肤肉眼及组织学观察结果

3.3 G-Mr-T的正交实验设计结果

3.4 微针阵列针刺后皮肤反应结果

3.5 钙黄绿素染色结果

3.6 组织学观察结果

3.7 HA在体透皮实验结果

3.7.1 涂药皮肤HA的含量

3.7.2 涂药肉膜层HA的含量

第四章 讨论

第五章 小结

参考文献

英语缩略词

在学期间的研究成果

致谢