感觉神经节对脑运动神经元轴突生长的影响及其分子机制

摘要

『目的』　　通过体外共培养鸡胚感觉神经节与后脑第8对菱形区( thombomere 8，r8)，研究感觉神经节对脑运动神经元轴突生长的影响及其分子机制。旨在全面、系统地探讨胚胎发育阶段影响脑运动神经元轴突生长的因素，进而为神经系统发育、运动神经元损伤的修复与再生及其它神经系统疾病的研究提供实验依据。　　『方法』　　将发育至HH18、25、30和36期鸡胚的三叉神经节(Trigeminal ganglion，T)、岩神经节(Petrosal ganglion，P)、结状神经节(Nodose ganglion，N)、膝状神经节(Geniculate ganglion，G)、前庭耳蜗神经节(Vestibulo-acoustic ganglion，VA)和背根神经节(Dorsal root ganglion，DRG)分别与发育至HH17-19期鸡胚双边r8(以下简称，r8)体外共培养于Ⅰ型胶原蛋白凝胶中，并以常规培养液培养4天，BEN抗体免疫荧光组织化学染色观察并拍照、分析。　　将分离r8体外单独培养于Ⅰ型胶原蛋白凝胶中，并分别以BSA培养液(Control组)、BDNF蛋白培养液（10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml，BDNF组）和NGF蛋白培养液（10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml，NGF组）培养4天，3A10抗体免疫荧光组织化学染色观察并拍照，统计r8新生脑运动神经元轴突的数量和长度。　　将BSA-beads(Control组)、BDNF-beads (0.1μg/μl、0.5μg/μl、1.0μg/μl，BDNF-beads组)禾口NGF-beads（0.1μg/μl、0.5μg/μl、1.0μg/μl，NGF-beads组）分别与r8体外共培养于Ⅰ型胶原蛋白凝胶中，并以常规培养液培养4天，3A10抗体免疫荧光组织化学染色观察并拍照、分析。　　将发育至25期的鸡胚三叉神经节与r8体外共培养于Ⅰ型胶原蛋白凝胶中，并分别以PBS培养液(Control组)、BDNF蛋白抗体培养液(20μg/ml，BDNF-Ab组)和NGF蛋白抗体培养液（120μg/ml，NGF-Ab组）培养4天，BEN抗体免疫荧光组织化学染色观察并拍照、分析。　　将BDNF-beads (1.0μg/μl)、NGF-beads (1.0μg/μl)及HH25期鸡胚三叉神经节分别与r8体外共培养于Ⅰ型胶原蛋白凝胶中，并均以常规培养液(Control组)、DMSO培养液（DMSO组）、Trk抑制因子培养液（DMSO+Tyrphostin A9组）、PLCγ抑制因子培养液（DMSO+U73122组）、PI-3K抑制因子培养液（DMSO+LY294002组）和MEK抑制因子培养液（DMSO+U0126组）培养4天，3A10或BEN抗体免疫荧光组织化学染色观察并拍照、分析。　　根据r8组织团与神经节或神经营养因子蛋白-beads的空间位置关系，将面向神经节或神经营养因子蛋白-beads的一侧称为r8内侧（ganglion/beads side），而与之相对的一侧则称为外侧(control side)。以新生轴突的数量和长度为脑运动神经元轴突生长的量化指标，统计上述共培养后r8内、外两侧脑运动神经元轴突的数量和长度。　　『结果』　　(1)不同神经节对r8脑运动神经元轴突生长的影响：HH25、30和36期鸡胚三叉神经节与r8共培养后，r8内侧脑运动神经元轴突的数量和长度均极显著多于和长于外侧(p＜0.01，p＜0.01)，呈非对称性偏侧生长特点，而HH18期r8内、外侧脑运动神经元轴突的数量和长度未见显著差异( p＞0.05，p＞0.05)，呈对称性生长特点。HH30和36期鸡胚的岩神经节、结状神经节及前庭耳蜗神经节与r8共培养，r8内侧脑运动神经元轴突的数量和长度均（极）显著多于和长于外侧(p＜0.01或p＜0.05)，呈非对称性偏侧生长特点；HH18和25期r8内、外两侧脑运动神经元轴突的数量和长度均未见显著差异( p＞0.05，p＞0.05)，呈对称性生长特点。HH36期鸡胚的膝状神经节与r8共培养后，r8内侧脑运动神经元轴突的数量和长度均极显著多于和长于外侧(p＜0.01，p＜0.01)，呈非对称性偏侧生长特点，而其它3个时期r8内、外两侧脑运动神经元轴突的数量和长度均未见显著差异(p＞0.05，p＞0.05)，呈对称性生长特点。HH18、25、30和36期鸡胚的背根神经节与r8共培养，r8内侧脑运动神经元轴突的数量和长度均（极）显著多于和长于外侧(p＜0.01或p＜0.05)，呈非对称性偏侧生长特点。　　(2) BDNF蛋白培养液、NGF蛋白培养液对r8脑运动神经元轴突生长的影响：与Control组相比，三种不同浓度的BDNF组r8脑运动神经元轴突的数量和长度均极显著增多和增长(p＜0.01，p＜0.01)，呈非对称性偏侧生长特点；与Control组相比，三种不同浓度的NGF组r8脑运动神经元轴突的数量均极显著增多(p＜0.01)，对于其轴突长度仅25ng/ml和50ng/ml NGF组显著增长(p＜0.05，p＜0.05)，而10ng/ml NGF组神经元轴突长度虽呈增长趋势，但差异不显著(p＞0.05)。　　(3)BDNF-beads、NGF-beads对r8脑运动神经元轴突生长的影响：Control组r8内侧和外侧脑运动神经元轴突数量与长度均无显著差异(p＞0.05，p＞0.05)，呈对称性生长的特点。除0.1μg/μl BDNF-beads组外，其它两个BDNF-beads组r8内侧脑运动神经元轴突生长旺盛，其数量密集，长度较长，而外侧神经元轴突数量较少，长度较短，差异均极显著( p＜0.01，p＜0.01)，呈非对称性偏侧生长特点；三种不同浓度的NGF-beads组r8内侧脑运动神经元轴突生长旺盛，其数量和长度均（极）显著多于和长于外侧（p＜0.01或p＜0.05），呈非对称性偏侧生长特点。　　(4) BDNF蛋白抗体、NGF蛋白抗体对r8脑运动神经元轴突生长的影响：Control组r8内侧脑运动神经元轴突生长旺盛，数量密集，长度较长，而外侧轴突数量较少，长度较短，差异均极显著(p＜0.01，p＜0.01)，呈非对称性偏侧生长。BDNF-Ab组与NGF-Ab组r8内、外两侧脑运动神经轴突数量与长度均无显著差异( p＞0.05，p＞0.05)，均呈对称性生长特点。　　(5)抑制因子对r8脑运动神经元轴突生长的影响：①BDNF-beads与r8共培养，抑制因子对r8脑运动神经元轴突生长的影响：与Control组相比，DMSO组r8脑运动神经元轴突的生长状况无明显差异，亦呈非对称性偏侧生长特点；DMSO+Tyrphostin A9组，r8内侧和外侧均未见明显脑运动神经元轴突的生长：DMSO+U73122组、DMSO+LY294002组及DMSO+U0126组r8内侧和外侧脑运动神经元轴突生长状况无明显差异，均呈对称性生长的特点。②NGF-beads与r8共培养，抑制因子对r8脑运动神经元轴突生长的影响：与Control组相比，DMSO组r8脑运动神经元轴突的生长状况无明显差异，亦呈明显非对称性偏侧生长特点：DMSO+Tyrphostin A9组，r8内侧和外侧均未见明显脑运动神经元轴突的生长：DMSO+U73122组、DMSO+LY294002组及DMSO+U0126组r8内侧和外侧脑运动神经元轴突生长状况无明显差异，均呈对称性生长的特点。③三叉神经节与r8共培养，抑制因子对r8脑运动神经元轴突生长的影响：与Control组相比，DMSO组r8脑运动神经元轴突的生长状况无明显差异，亦呈明显非对称性偏侧生长特点；DMSO+Tyrphostin A9组，r8内侧和外侧均未见明显脑运动神经元轴突的生长：与同组外侧相比，DMSO+U73122组、DMSO+LY294002及DMSO+U0126组r8内侧脑运动神经元轴突生长均较为旺盛，均表现出明显非对称性偏侧生长的特点。同时，与DMSO组相比，DMSO+U73122组、DMSO+LY294002组和DMSO+U0126组3组r8脑运动神经元轴突生长的总体状况无明显差异。　　『结论』　　鸡胚三叉神经节、岩神经节、结状神经节、膝状神经节、前庭耳蜗神经节及背根神经节对r8脑运动神经元轴突的生长均具有显著促进作用，且除背根神经节外，这种促进作用均表现出阶段依赖性关系。其中，三叉神经节促进r8脑运动神经元轴突生长的作用与其分泌的BDNF蛋白和NGF蛋白有关，并且这种促进作用受包括Trk、PLCγ、PI-3K和MEK参与的多条信号转导通路的调控。

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