人血管内皮生长因子及其受体在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及功能研究

摘要

肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤新血管的生成(Angiogenesis)，而肿瘤新血管的生成是在肿瘤血管生成刺激因子和抑制因子的共同调控下完成的。人血管内皮生长因子(human vascular endothelial growth factor，hVEGF)是肿瘤血管新生中最重要的刺激因子，也是目前肿瘤血管生成因子中研究最多和最广泛的课题。VEGF通过作用于特异性的VEGF受体(VEGF Receptor，VEGFR)发挥生物学作用。 本研究以人胎盘cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法扩增出VEGF165基因与其可溶性VEGF受体1(soluble VEGF Receptor-1，sF1t-1)基因(前三个Ig样结构域)，将扩增出来的目的基因与pMD19-T载体连接并将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pMD19-T/VEGF165和pMD19-T/sF1t-1克隆质粒，碱性裂解法提取克隆质粒。用EcoRI与NotI两种限制性内切酶对pMD19-T/VEGF165质粒、pMD19-T/sFlt-1质粒与pGEX-4T-1载体进行双酶酶切，得到双酶酶切目的片断和pGEX-4T-1线性载体。用罗氏快速连接反应试剂盒将双酶酶切目的片断与线性载体相连，连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pGEX-4T-1/VEGF165与pGEX-4T-1/sF1t-1表达质粒。碱性裂解法提取pGEX-4T-1/VEGF165与pGEX-4T-1/sF1t-1质粒，并将提取的质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞，成功地构建大量表达GST-VEGF165和GST-sF1t-1蛋白的工程菌。 上述两种构建成功的工程菌在37℃条件下，使用1mM IPTG诱导GST-VEGF165与GST-sF1t-1融合蛋白试表达，试表达产物运用10％的SDS-PAGE法鉴定分析，分析结果显示目的蛋白大小与理论值相符，说明重组质粒序列和读码框正确；运用AlphaDigiDocTM影像分析技术对SDS-PAGE电泳胶融合蛋白条带进行纯度分析，分析结果显示GST-VEGF165与GST-sF1t-1蛋白分别占菌体总蛋白的39.5％和53.9％。随后，进行融合蛋白的大量表达，大量表达的菌体经过离心收集菌体沉淀，使用100μg/ml溶菌酶裂解细菌，3％TritonX-100与1.5％十二烷基肌氨酸钠(N-Lauroylsarcosine，Sarkosyl)溶解包涵体。经10％ SDS-PAGE分析，分析结果显示成功地获得了含有可溶性目的蛋白的细胞裂解液，使用谷胱甘肽Sepharose4B胶对细胞裂解液中的目的蛋白进行亲和层析纯化。 通过HPLC法检测GST-VEGF165蛋白质的纯度，检测结果显示纯化后的GST-VEGF165蛋白主要以单体和二聚体的形式存在；通过免疫印记(Western blotting，WB)法检测纯化后的GST-VEGF165与GST-sF1t-1蛋白的抗体结合能力，检测结果显示纯化后的GST-VEGF165与GST-sF1t-1蛋白均具有与其对应抗体特异性结合的能力；通过鸡胚绒毛尿囊膜试验检测GST-VEGF165对鸡胚绒毛尿囊膜血管的作用，检测结果显示大肠杆菌表达GST-VEGF165可以诱导毛细血管的生成、诱导大血管变粗，且具有GST-VEGF165剂量依赖性；通过GST-VEGF165与其受体VEGFR-1(Sigma-Aldrich提供，昆虫细胞表达)的结合实验检测大肠杆菌表达GST-VEGF165与其受体的结合性，检测结果显示大肠杆菌表达GST-VEGF165能与受体结合，且结合呈GST-VEGF165剂量依赖性。 传统的包涵体纯化方法通常为包括包涵体的清洗、包涵体的溶解、目的蛋白的纯化与复性在内的三步法。本研究在国际国内首次将阴离子型烷基去垢剂Sarkosyl溶解、复性包涵体的方法引入到VEGF165及其受体的表达纯化过程中，将传统的VEGF及其受体包涵体纯化的三步法改进为包括包涵体的溶解、目的蛋白的纯化在内的二步法，为VEGF165及其可溶性受体sF1t-1的临床实验研究提供了一种简单、有效的目的蛋白纯化方式。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分人血管内皮生长因子在肿瘤广谱筛查和临床诊断中的应用

一 恶性肿瘤是全球健康的第一大杀手

二 早发现和早诊断是肿瘤防治的关键

三VEGF是肿瘤筛查和辅助诊断新的和广谱标志物

(1) VEGF及其受体生物学

(2) Folkman理论与肿瘤生长

四 血管生长因子(VEGF)是最主要的血管生成刺激因子

(1) VEGF与肿瘤诊断研究进展

(2) VEGF与抗肿瘤治疗研究进展

五 VEGF在肿瘤广谱筛查和辅助诊断研究进展

(1) VEGF是肿瘤广谱筛查和辅助诊断血液标志物

(2) VEGF与肿瘤预后

(3) VEGF治疗评估与监测

(4) VEGF复发的监测

(5) 几个相关问题

六 VEGF酶联免疫方法学研究进展

七 科学问题和发展方向

参考文献

第二部分hVEGF和sFlt-1在原核表达系统中的克隆、表达、纯化及功能性研究

一概述

二、技术路线

三实验材料

1 大肠杆菌感受态细胞

2 载体

3分子生物学试剂

4化学试剂及药品

5仪器设备

四、实验方法及过程

1 VEGFl65及sFlt-1目的基因的获得

2重组克隆载体pMDl9-T／VEGFl65和pMDl9-T／sFlt．1的构建并转化

3重组表达载体pGEX-4TolNEGFl65和pGEX-4T-1／sFlt-1的构建和转化

4 目的蛋白VEGFl65表达条件的确定

5 GST-VEGF165和GST-sHt-1蛋白的大量表达及蛋白与Scpharosc 4B胶结合优化

6与谷胱甘肽Sepharose 4B胶结合的GST-VEGF165、GST-sFIt-1蛋白的洗脱方法的优化

7 Western Blot分析GST-VEGFl65和GST-sFlt-1两种蛋白表达

8纯化后的目的蛋白纯度分析

9纯化后目的蛋白浓度测定

10鸡胚尿囊膜实验

11结合实验

五实验结果

1 目的基因的获得

2重组克隆载体pMD19-T/VEGFl65与pMDl9-T/sFlt-1的构建并转化

3重组表达载体pGEX-4T-1／VEGFl65、pGEX-4T-1／sFlt-1的构建并转化

4 目的蛋白VEGF165和sFlt-1表达条件的确定

5 目的蛋白的大量表达及蛋白与Sepharose4B胶结合并洗脱的优化

6纯化后的目的蛋白纯度分析

7 Western Blot分析GST-VEGFl65和GST-sFIt-1两种蛋白表达

8尿囊膜实验

9结合实验

六讨论

一 pGEX-4T-1／VEGF165和pGEX-4T-1／sFlt-1质粒的构建

二 GST-VEGF165和GSTosFIt-1蛋白在大肠杆菌中的表达

三 表达目的蛋白GST-VEGF165和GST-sFlt-1的大肠杆菌的裂解、纯化

四 GST-VEGF165和GST-sFlt-1蛋白相关功能性试验

七结论

参考文献

附录

硕士在读期间发表论文

致谢