激光共聚焦和双光子显微镜对细胞的成像及植物细胞Cytomixis的研究

摘要

近十年来，由于生物荧光成像技术和荧光探针技术的飞速发展，以及生物活体组织和细胞的三维成像在生命科学研究中的重要意义，目前，激光共聚焦扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microcopy，简称CLSM)是生物细胞和组织的三维成像最有效的设备，已经普遍的在各个实验室广泛应用。但由于一些因素的制约，成像效果还没有达到非常理想的目标。近年来，光学显微镜技术中的一个最引人注目的成就是双光子激发现象(Two Photon Excitation，简称TPE)在激光共聚焦扫描显微镜中的广泛应用。双光子技术可以使我们无需使用紫外光源就能达到检测紫外荧光探针的目的。双光子激光高度的三维空间分辨性(激发在很小的三次方空间内)和大的穿透深度使双光子荧光成像技术迅速在生物细胞和组织(尤其是植物细胞组织)的活体三维成像研究方面获得了广泛的应用。　　 同样，利用双光子激光扫描显微镜对活体细胞成像也存在一个关键问题：那就是目前缺乏有效的双光子荧光探针，因而利用传统荧光探针，双光子激光扫描显微镜也很难使不透明的、较厚的活体组织在较深的层面上进行清晰的荧光成像，目前国际上在活体植物不透明组织中成像研究中的最好记录是60-70nm，这也是当前生物学界对激光扫描共聚焦显微镜和双光子激光扫描显微镜在应用中存在争论的焦点所在。因此，缺乏大吸收截面的荧光探针分子严重制约了双光子激光扫描显微镜的广泛应用。　　 本文首先通过利用各种传统的荧光探针和激光共聚焦显微镜以及双光子激光扫描显微镜，对各种细胞及细胞内的成分进行成像研究，从而对激光共聚焦显微镜及双光子激光扫描显微镜细胞成像的技术有一个深入的研究和总结。其次，通过研究双光子荧光探针的特性，我们合成并表征了几个具有高灵敏度、高双光子吸收截面的双光子核酸荧光探针，BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC，同时利用这些探针对细胞核的双光子成像进行了系统的研究，为生命科学工作者们提供了几个细胞膜半通透性的、真正意义上的双光子核酸荧光探针。第三，通过利用高效荧光探针和激光共聚焦显微镜以及双光子激光扫描显微镜对活体植物细胞融合现象进行三维动态成像研究，为从根本上解决细胞融合现象研究中的争论，以及细胞融合的发生机理研究，建立了一个崭新的研究体系和平台。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写

声明

第一章前言

一、激光共聚焦扫描显微镜的研究进展

1、激光共聚焦扫描显微镜的介绍

2、激光共聚焦扫描显微镜成像的原理

3、传统光学显微镜的不足

4、激光共聚焦扫描显微镜的组成

5、激光共聚焦扫描显微镜的一些重要参数选择

6、激光共聚焦扫描显微镜的优越性和研究领域

7、激光共聚焦显微镜在生物学上的应用

8、激光共聚焦扫描显微镜荧光探针的选择和应用

9、绿色荧光蛋白

二、双光子激光扫描显微镜的研究进展

1、双光子激光扫描显微镜简介

2、激光共聚焦显微镜和双光子激光扫描显微镜的比较

3、双光子吸收机制

4、荧光材料的双光子吸收截面σ

5、双光子激光器

6、双光子荧光探针

三、植物细胞Cytomixis的研究进展

1、植物细胞Cytomixis的简介

2、植物细胞Cytomixis的发生过程

3、植物细胞Cytomixis的结果和意义

四、本课题研究的目的和意义

1、激光共聚焦和双光子激光扫描显微镜对细胞成像研究的目的和意义

2、植物细胞Cytomixis研究的目的和意义

第二章材料和方法

一、实验材料

1.动物细胞

2、植物材料

3.质粒pCAMBIA1300

4、菌株

5、主要试剂

6、荧光染料

二、实验方法

1、HepG2、Chang Liver细胞的培养

2、Hela细胞的培养

3、用荧光染料DiO及DiI标记HepG2和Chang Liver细胞

4、用双光子荧光染料MVEC、BMVEC和2,7-BHVC标记Hela细胞

5、用荧光染料PI、DAPI、MVEC、BMVEC和2,7-BHVC等对植物材料烟草和拟南芥避光染色

6、激光共聚焦扫描显微镜观察共培养的HepG2和Chang Liver细胞

7、对MVEC、BMVEC和2,7-BHVC标记Hela细胞用双光子激光扫描显微镜成像

8、对荧光染料PI、DAPI、MVEC、BMVEC和2，7-BHVC等标记的植物材料烟草和拟南芥用激光共聚焦和双光子激光扫描显微镜成像

9、拟南芥菜无菌培养

10、转化植株的荧光鉴定

11、杂交获得双转化植株

12、阿勃缺体小麦花粉母细胞中Cytomixis的分析

13、转基因烟草(H2B-CFP)细胞中Cytomixis的活体成像

第三章实验结果

一、双光子核酸荧光探针BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC的设计合成、光学性能表征和荧光成像

1、BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC的设计、合成

2、BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC的光学性能表征

3、BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC的荧光成像研究

二、利用激光共聚焦扫描显微镜和双光子激光扫描显微镜，对各种荧光探针和荧光蛋白标记的动植物细胞和组织的成像结果

1、对HepG2及Chang Liver细胞之间的纳米管通道的成像

2、动物细胞各组分多探针标记，激光共聚焦扫描显微镜和双光子激光扫描显微镜多通道扫描成像结果

3、PI对植物不同组织的染色结果

4、DAPI标记的植物细胞核的双光子激光扫描显微镜成像结果

5、植物细胞活体有丝分裂的双光子成像

6、转基因拟南芥(Actin-GFP和Tublin-GFP)叶片组织中GFP的激光共聚焦扫描显微镜成像

三、单转基因(H2B-CFP)拟南芥植株的荧光鉴定结果

四、植物细胞Cytomixis的实验结果

1、阿勃小麦缺体系中花粉母细胞细胞融合(Cytomixis)的分析结果

2、转基因烟草(H2B-CFP)幼苗细胞中Cytomixis的活体成像结果

第四章讨论

第五章结论与展望

第六章图版

参考文献

博士期间所取得的研究成果

致谢