声明
主要缩略语表
摘要
1 前言
1．1 ω干扰素的研究背景
1．1．1 干扰素的来源及分类
1．1．2 干扰素的基本特性
1．1．3 干扰素的生物学活性
1．1．4 干扰素的临床应用
1．1．5 干扰素-ω
1．2 基因工程药物表达系统及其基本生产过程
1．2．1 基因工程概述
1．2．2 基因工程药物表达系统
1．2．3．基因工程药物的基本生产过程
1．3 本文的创新之处
1．3．1 ω干扰素序列的设计思想
1．3．2 选用巴斯德毕赤酵母系统表达IFN-ω
1．3．3 建立一套毕赤酵母表达IFN-ω的发酵及纯化工艺
2 材料与方法
2．1 材料
2．1．1 菌株及质粒
2．1．2．主要试剂及耗材
2．1．3．主要仪器及设备
2．1．4．主要溶液的配制
2．2 方法
2．2．1 引物设计
2．2．2 工程菌的构建
2．2．3 PAO815SM1-IFN-ω GS115工程菌的筛选
2．2．4 5L发酵罐发酵培养
2．2．5 IFN-ω蛋白的纯化
2．2．6 IFN-ω蛋白的质量分析
2．2．7 IFN-ω的一级结构分析
3 结果
3．1 工程菌的构建
3．1．1 目的基因的获取
3．1．2 测序质粒的构建及目标DNA的测序分析
3．1．3 pAO815SM1-IFN-ω表达质粒的构建及质粒酶切分析
3．1．4 酵母转化试验
3．2 工程菌的筛选
3．2．1 菌种保存
3．2．2 高表达重组子筛选
3．3 高效表达条件的优化
3．3．1 最适诱导pH值的优化
3．3．2 最适诱导甲醇浓度的优化
3．4 5L发酵罐发酵培养
3．5 IFN-ω蛋白的纯化
3．5．1 Millipore P2B005A01超滤膜捕获与初步纯化
3．5．2 SP Sepharose Fast Flow-100 mL纯化
3．5．3 CM Sepharose Fast Flow-40 mL浓缩
3．5．4 Seperdex 75分离替换缓冲液
3．5．5 过滤除菌及分装
3．6 IFN-ω蛋白的质量控制
3．6．1 蛋白质浓度的测定
3．6．2 IFN-ω纯度的分析
3．6．3 质谱分析IFN-ω的分子量(MALDI-TOF)
3．6．4 IFN-ω胰酶酶切肽图的分析(HPLC)
3．6．5 测定IFN-ω的N端序列
3．6．6 IFN-ω的活性测定
3．6．7 IFN-ω紫外扫描特性
3．7 IFN-ω的一级结构分析
3．7．1 IFN-ω分子的氨基酸序列分析
3．7．2 分析IFN-ω分子的两对二硫键
4 讨论
4．1 用PCR技术制备目的基因
4．2 表达载体的选择
4．3 表达菌株的选择
4．4 质粒在大肠杆菌中的转化
4．5 表达质粒在酵母细胞中的转化及转化子的筛选
4．6 毕赤酵母高表达条件的优化
4．7 纯化的设计思路
4．8 活性测定
4．9 IFN-ω的质量分析
4．10 IFN-ω的一级结构分析
5 结论
6 展望
参考文献
8 已发表论文
致谢
厦门大学;
