深海嗜热细菌热稳定木聚糖酶的性质及噬菌体GSVE1功能基因的研究

摘要

陆地资源开发已日趋饱和的今天，海洋资源的开发和利用日渐成为国际上关注的焦点。嗜热微生物作为其中重要的组成部分，不仅在生物系统进化中具有特殊地位，蕴涵生命进化历程中丰富的信息；其代谢过程中特殊的产物，尤其是嗜热酶在工业上有着广阔的应用前景，具有重要的研究意义。同时，对高温噬菌体的深入研究，将有助于了解其独特的生物化学和分子生物学特征，特别是相关结构基因及寻找强启动子方面的研究，将为嗜热菌表达系统的人工载体构建奠定基础。 本研究从太平洋深海热液区筛选分离到一株高产木聚糖酶的嗜热菌MT-1，根据细菌16S rDNA序列分析，该嗜热菌属于Geobacillus sp.。从中克隆到一个编码331个氨基酸的木聚糖酶基因，并在Escherichia coli中高效表达。酶学性质测定结果表明，重组木聚糖酶的性质与粗酶类似，其最适温度和最适pH值分别为70℃和7.0，当温度高达90℃时，仍具有90％以上的酶活，且在pH5.5-10范围内均可检测到较强的酶活。除了SDS对重组木聚糖酶酶活具有显著的抑制作用外，其他酶抑制剂PMSF、EDTA、2-ME、DTT(1mM)和去污剂Tween 20、Chaps、Triton X-100(0.1％)对酶活均无显著影响。金属离子对重组木聚糖酶酶活的影响研究表明，一价金属离子(Li+、Na+、K+)对酶活略有促进作用，除Mg2+、Ca2+、Ba2+以外的二价和三价金属离子普遍对酶活有强烈的抑制作用。 目前，没有适合于嗜热细菌进行蛋白重组表达的载体，为了探索采用噬菌体构建嗜热菌表达系统，在本实验室已获得的深海嗜热细菌噬菌体GSVEl的基础上，研究了噬菌体尾部蛋白的功能。根据噬菌体GSVEl全基因组测序结果和开放阅读框的分析结果，对其中预测编码噬菌体结构蛋白的vp192基因开展研究，以噬菌体基因组为模板，克隆了vp192基因，并在E. coli中进行VP192蛋白的表达和纯化，制备抗体；Northern blot和Western blot结果显示，在噬菌体感染宿主菌后不同时期，vp192基因的转录和表达水平略有差异，大约在4h时达到最大值；免疫电镜结果显示，vp192基因如预测，编码噬菌体尾部的一个重要结构蛋白。进一步分析表明，该vp192基因处于一个尾部相关基因高度有序排列的功能基因簇的起始端，其下游的一段序列可能通过移码翻译的机制编码两个具有相同N末端的蛋白，随之对该移码翻译机制进行初步探索，将该段DNA序列克隆到带有GST标签的pGEX-4T-2表达载体中，并用GST单克隆抗体进行检测，发现同时存在两种蛋白，分子量大小与预期一致，分别为38 kDa和49 kDa，且两种蛋白在表达量上存在一定比例。

目录

声明

摘要

1前言

1.1嗜热菌的研究概况

1.1.1嗜热菌的分类与鉴定

1.1.2嗜热菌的应用

1.2木聚糖酶的研究进展

1.2.1木聚糖的结构

1.2.2微生物木聚糖降解系统及生物合成的调节机制

1.2.3木聚糖酶的理化性质

1.2.4木聚糖酶的分类

1.2.5木聚糖酶的功能结构域

1.2.6木聚糖酶的应用

1.3嗜热菌噬菌体的研究进展

1.3.1噬菌体的形态及分类

1.3.2高温噬菌体的分布及研究意义

1.3.3嗜热细菌噬菌体GSVE1基本特征

1.3.4核糖体的移码翻译

1.4本论文研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1嗜热菌的筛选与鉴定

3.2热稳定木聚糖酶基因的克隆及木聚糖酶性质的研究

3.2.1产木聚糖酶菌株的筛选与鉴定

3.2.2热稳定木聚糖酶基因的克隆与序列分析

3.2.3热稳定木聚糖酶基因的重组表达和纯化

3.2.4热稳定木聚糖酶的酶学性质

3.3嗜热细菌噬菌体GSVE1尾蛋白编码基因及其基因簇研究

3.3.1尾部功能基因簇相关序列分析

3.3.2功能基因簇中vp192基因的研究

3.3.3移码翻译机制的验证

4讨论

4.1热稳定木聚糖酶的研究

4.2嗜热细菌噬菌体GSVE1功能基因簇的研究

5结论与展望

参考文献

附录 攻读硕士学位期间发表和待发表的论文

致谢