椰扁甲啮小蜂卵期寄生因子特性及其对寄主水椰八角铁甲蛹的免疫抑制作用

摘要

椰扁甲啮小蜂Tetrastichus brontispae（Ferrière）属小蜂总科姬小蜂科Eulophidae，可用于防治我国南方重大入侵害虫水椰八角铁甲Octodonta nipae Maulik。但关于椰扁甲啮小蜂对寄主水椰八角铁甲蛹的免疫调控机制还不明确。因此，本文从椰扁甲啮小蜂寄生因子的毒性及水椰八角铁甲蛹的免疫抵抗能力两方面，分析了椰扁甲啮小蜂与寄主水椰八角铁甲蛹的免疫互作机制。主要研究结果如下：　　1）明确了椰扁甲啮小蜂卵表面寄生因子的种类及其在蜂卵抵抗寄主免疫中的作用　　对椰扁甲啮小蜂卵期寄生因子的透射电镜和扫描电镜观察发现，该蜂不含多分DNA病毒（polydnavirus，PDV）和类病毒纤丝（virus-like filaments，VLF）。间接免疫荧光和免疫印迹实验观察发现椰扁甲啮小蜂卵表面可能存在一种对蜂卵起保护，可被蜗牛凝集素（Helix pomatialectin）结合的蛋白。利用H.pomatia lectin结合蛋白血黏素Hemomucin的简并引物扩增得到类脂细胞膜相关蛋白序列。类脂细胞膜相关蛋白抗体孵育初产蜂卵后，寄主水椰八角铁甲蛹对寄生蜂蜂卵的包囊指数显著升高，表明该蛋白对蜂卵有保护作用，该蛋白在寄生后2h的水椰八角铁甲蛹内蜂卵中的转录水平最高。　　2）明确了椰扁甲啮小蜂毒器官结构及主要寄生因子毒液蛋白的组成　　光镜下显示椰扁甲啮小蜂毒器官由肠状毒腺和泪滴状毒囊组成。透射电镜显示毒腺主要由基膜层、分泌细胞层、导管细胞层和内膜层组成；毒囊主要由薄的肌肉层、上皮细胞层和内膜层组成。　　Label-free非标记定量蛋白质组学检测到椰扁甲啮小蜂毒液器官含1505个毒液蛋白，大致分为结合蛋白、酶、蛋白酶抑制剂和其它蛋白等几类；毒液内存在一些该寄生蜂的特异毒液蛋白，如venom protein r-like等。将所有蛋白进行Gene Ontology功能注释与Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes通路分析发现，大量蛋白参与蛋白的合成加工，表明毒器官存在蛋白合成及分泌功能，符合寄生蜂毒液器官的特征。　　3）明确了椰扁甲啮小蜂寄生对寄主水椰八角铁甲蛹的免疫调节过程　　透射电镜及荧光染色发现水椰八角铁甲蛹体内共存在五种血细胞，即原血细胞、粒血细胞、浆血细胞、类绛色细胞和珠血细胞；其中主要免疫血细胞类型为粒血细胞、浆血细胞和类绛色细胞。　　与同期未寄生的蛹相比，水椰八角铁甲蛹在寄生后24h粒血细胞数量显著增加，寄生后96h血细胞的存活率和延展百分率显著升高；与注射PBS相比，毒液与卵巢液混合物在注射后24和48h分别引起了粒血细胞和浆血细胞延展百分率的显著升高。上述结果表明椰扁甲啮小蜂不主动抑制寄主的免疫反应，且椰扁甲啮小蜂毒液与卵巢液在应对水椰八角铁甲蛹的细胞免疫方面可能具有协同作用。　　与同期未寄生蛹相比，在寄生后12与72h水椰八角铁甲蛹的酚氧化酶活性显著升高，而寄生后96h水椰八角铁甲蛹的黑化反应被抑制；毒液及卵巢液的注射没有引起寄主水椰八角铁甲蛹酚氧化酶活性的显著改变。结果表明椰扁甲啮小蜂寄生初期可引起寄主体液免疫响应，而在后期寄主的体液免疫明显被抑制。　　综合本文研究结果，椰扁甲啮小蜂体内不含PDV与VLF，寄生初期主要的保护因子是卵表的类脂细胞膜相关蛋白，毒液是椰扁甲啮小蜂主要的寄生因子。在椰扁甲啮小蜂的寄生和混合物注射初期，寄主水椰八角铁甲蛹的免疫反应（细胞和体液免疫）被激活，而在椰扁甲啮小蜂幼虫初期，寄主水椰八角铁甲蛹的体液免疫被抑制。

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