龙眼子叶胚发育相关的若干基因克隆及序列分析

摘要

龙眼(Dimocarpus Longan Lour)属无患子科(Sapindaceae)龙眼属，是我国南方诸省较重要而有特色的一种热带亚热带木本果树。由于龙眼合子胚遗传背景复杂，童期长，阻碍对其胚胎发育相关基因的研究。本文以龙眼子叶胚为材料，建立cDNA-AFLP技术体系，分析龙眼胚胎发育相关的基因差异表达，为研究龙眼胚胎发育奠定基础。建立了RACE体系，克隆了看家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)，并作为后续试验的内参；以这个RACE体系克隆了一系列与龙眼胚胎发育相关的基因，同时对这些基因在胚胎发育中的表达特性也进行了研究。 1利用cDNA-AFLP技术分析龙眼子叶胚的发育 分别以小量法和大量法提取‘红核子’龙眼谢花后35天子叶胚(早期子叶胚)和50天“红核子”龙眼子叶胚(晚期子叶胚)的RNA，经过合成双链cDNA、酶切、加接头、预扩增和选择性扩增一系列步骤，建立适宜于龙眼子叶胚的cDNA-AFLP分析体系，得到了条带清晰、对应良好、信号强度基本一致、分布均匀的cDNA-AFLP指纹图谱，对41个差异片段回收克隆和序列分析，发现其中21个与已知功能基因具有高度同源性，这些基因的功能主要涉及侧生器官的离轴极性、糖酵解、能量代谢、离子转运、细胞壁伸长、细胞周期调控、RNA转录、RNA翻译和调控、蛋白磷酸化调控和降解、信号转导等；另外20个片段与已知基因的同源性较低或未发现同源性。随机挑选7个进行RACE扩增，RT-PCR检测其表达情况。 2龙眼子叶胚GAPDH基因全长cDNA克隆及序列分析 根据Super SMARrTM PCR cDNA Synthesis Kit特点，设计两端锚定引物，同时根据与已知的GAPDH基因高度同源的EST序列设计巢式引物，成功地扩增出该基因的3′端和5′端，说明这种RACE方法适合用于扩增龙眼子叶胚的基因。 序列分析表明，该基因的cDNA全长为1395bp，包括一个长1008bp，编码336个氨基酸的开放阅读框，其核苷酸和氨基酸序列与其他物种的GAPDH基因具有高度同源性。GAPDH基因是组成型表达，可以作为内参基因。 3龙眼子叶胚离轴极性基因YABBY2的克隆和序列分析 采用巢式的RACE方法，获得与拟南芥YABBY2同源的基因，共获得三个全长YAB2-1，YAB2-2，YAB2-3和三个片段YAB24，YAB2-5，YAB2-6。 生物信息学分析表明这几个基因有不同的3′端非编码区和5′端非编码区，有高度一致的开放阅读框，在YAB2-1，YAB2-2，YAB2-3的5′端非编码区发现疑似的IRES序列。 半定量RT-PCR分析表明YAB2-3在早期子叶胚显著地表达，在晚期子叶胚中微量表达；YAB2-1和YAB2-2在早期和晚期胚都显著表达，但早期表达量大；YAB2-4是微量表达的基因，在晚期胚胎表达量较大。 4龙眼胚胎FVE、Remorin、CCR4-NOT等基因克隆和序列分析 采用巢式的RACE方法，成功地扩增龙眼的FVE、Remorin、CCR4-NOT的全长序列，获得硫转运蛋白基因的5′端序列、脱水应答蛋白相关基因3′端序列和几丁质酶基因3′端序列。FVE基因具有WD40superfamily结构域，表达量极其显著，早期表达量较大；Remorin基因在早期胚中显著地表达，在晚期胚微弱地表达；CCR4-NOT基因在早期和晚期胚都显著表达，早期胚胎表达量较大；硫转运蛋白基因是微量表达的基因，在早期胚胎中表达量较大；几丁质酶基因也是微量表达的基因，在晚期胚胎表达量较大。脱水应答蛋白的相关基因在早期胚显著表达，但晚期胚微量表达。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章文献综述

1.1 龙眼分子生物学研究进展

1.1.1 龙眼品种分类和鉴定

1.1.2 龙眼开花和成花逆转研究

1.1.3 龙眼胚胎发育研究

1.2 cDNA-AFLP技术的应用

1.2.1 cDNA-AFLP技术分析植物发育基因表达

1.2.2 cDNA-AFLP技术分析植物逆境基因表达

1.2.3 cDNA-AFLP技术分析植物抗病和抗虫基因表达

1.2.4 cDNA-AFLP技术分析植物生理过程基因表达

1.3 本研究的目的和技术路线

第二章龙眼子叶胚不同发育时期cDNA-AFLP分析

2.1 材料

2.1.1 供试材料

2.1.2 仪器和试剂

2.2 试验方法

2.2.1 龙眼子叶胚总RNA的提取

2.2.2 双链cDNA的合成

2.2.3 cDNA-AFLP的引物合成和接头制各

2.2.4 酶切和加接头

2.2.5 预扩增

2.2.6 选择性扩增

2.2.7 琼脂糖电泳

2.2.8 聚丙烯酰胺电泳

2.2.9 银染

2.2.10 差异片段的克隆

2.2.11 差异片段序列分析

2.3 结果与分析

2.3.1 龙眼胚胎总RNA提取和cDNA合成

2.3.2 限制性酶切、接头连接、预扩增和选择性扩增

2.3.3 差异片段的克隆

2.3.4 差异条带的BLAST分析

2.4 小结和讨论

第三章龙眼子叶胚GAPDH基因的cDNA克隆及序列分析

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 RACE反应体系建立

3.2.3 GAPDH生物信息学分析

3.3 结果与分析

3.3.1 GAPDH基因的3'-RACE和5'-RACE

3.3.2 GAPDH基因cDNA ORF的获得

3.3.3 GAPDH基因全长cDNA序列分析

3.4 小结和讨论

第四章龙眼子叶胚YAB2基因的cDNA克隆及序列分析

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 YAB2基因的3'-RACE、5'-RACE及cDNA全长扩增

4.2.3 龙眼YAB2生物信息学分析

4.3 结果与分析

4.3.1 YAB2基因的的3'-RACE和5'-RACE

4.3.2 YAB2基因全长的获得

4.3.3 YAB2基因全长cDNA序列分析

4.3.4 YAB2基因的RY-PCR表达分析

4.4 小结和讨论

第五章龙眼子叶胚Remorin、FVE和CCR4-NOT基因 全长cDNA克隆及其他基因部分cDNA克隆与序列分析

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 3'-RACE和5'-RACE

5.2.3 生物信息学分析

5.3 结果与分析

5.3.1 Remorin基因的cDNA克隆、序列分析及RT-PCR表达分析

5.3.2 FVE基因的cDNA克隆、序列分析RT-PCR表达分析

5.3.3 CCR4-NOT基因的cDNA克隆、序列分析RT-PCR表达分析

5.3.4 硫转运蛋白、几丁质酶和脱水应答相关蛋白基因的3'或5'-RACE及RT-PCR表达分析

5.4 小结和讨论

总结

参考文献

附录

致谢

在学期间发表论文