农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病相关基因研究

摘要

DNA插入突变是标记、分离植物病原真菌功能基因的有效途径之一。本实验通过电转化法将双元载体pATMT1导入农杆菌AGL-1中，成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)转化，转化效率达每106个分生孢子>250个转化子，并得到了1500多个转化子。对部分转化子的继代培养和PCR检测，证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。用大麦叶片离体接种的方法快速测定稻瘟病菌转化子的致病性，发现2个致病缺陷突变体：A1-192和A1-139， 5个转化子的生长速度明显减慢，8个转化子的产孢量明显减少。 A1-192菌株不能侵入感病大麦和水稻品种的叶片。A1-139突变体则不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片，初步说明A1-139突变体的穿透和扩展进程同时被阻断。进一步的表型分析，发现A1-139突变体的产孢量显著下降，仅为野生菌株的0.7％，在疏水表面不能形成附着胞。 Southern杂交显示A1-192基因组中的T-DNA为单拷贝插入，而A1-139基因组中T-DNA插入是双拷贝的。上述结果表明，A1-192突变体表型的改变可能是由于T-DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。A1-139表型改变可能与两个T-DNA插入位点或其中之一的位点有关。 分别用嵌套式反向PCR和HiTAIL-PCR扩增得到A1-192和A1-139突变体的插入T-DNA侧翼基因组序列。通过克隆、测序和BLAST分析，A1-192菌株的T-DNA插入点位于编码一个MAPK基因-MPS1(MGG_04943.5)启动起始位点ATG上游456bp处。而A1-139突变体T-DNA双拷贝分别插在MGG_01057.5和MGG_10568.5基因的CDS中。

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1文献综述

1.1稻瘟病与稻瘟病菌

1.1.1稻瘟病菌的生活史

1.1.2稻瘟病菌的侵染循环

1.1.3稻瘟病菌是丝状病原真菌研究的模式生物

1.2根癌农杆菌介导的转化

1.2.1丝状真菌遗传转化的研究进展

1.2.2ATMT在丝状真菌上的应用现状

1.2.3根癌农杆菌(T-DNA)介导真菌遗传转化的机理

1.2.4根癌农杆菌介导的丝状真菌转化的特点

1.2.5根癌农杆菌介导丝状真菌转化的常规方法

1.3侧翼序列克隆技术研究

1.3.1反向PCR技术

1.3.2TAIL-PCR热不对称交错PCR

1.3.3外源接头PCR

1.3.4本实验室常用的侧翼序列克隆改进方法

1.4本研究的意义

2材料与方法

2.1实验菌株、质粒与培养条件

2.2培养基及抗生素

2.3常规分子生物学实验技术

2.3.1PCR反应

2.3.2酶切反应

2.3.3DNA的琼脂糖电泳

2.3.4DNA片段的凝胶回收

2.3.5连接反应

2.3.6大肠杆菌感受态细胞制备

2.3.7大肠杆菌转化

2.3.8CTAB法提取质粒DNA

2.4农杆菌的冻融法转化

2.4.1农杆菌AGL-1电感受态制备

2.4.2pATMT1质粒的电转化

2.4.3质粒PCR验证

2.5稻瘟病菌的T-DNA转化

2.6转化子DNA提取与分析

2.6.1CTAB法提取基因组DNA

2.6.2T-DNA插入的分子检测

2.6.3Southern杂交分析

2.7T-DNA插入侧翼序列的测序与插入位点的分析和验证

2.8突变子的表型分析

2.8.1生长速度与产孢量

2.8.2孢子萌发与附着胞形成观察

2.8.3致病性测定

2.8.4稻瘟病菌的有性生殖交配试验

3结果与分析

3.1双元载体pATMT1导入农杆菌

3.2稻瘟病菌的T-DNA转化

3.2.1方法优化

3.2.2诱导培养

3.2.3选择培养基中抗生素的选择

3.2.4转化效率

3.3突变体的检测

3.3.1突变体插入稳定性检测

3.3.2转化子潮霉素PCR检测

3.3.3突变体致病性测定结果

3.4T-DNA插入仙是翼序列的扩增

3.4.1嵌套式反向PCR扩增A1-192左臂侧翼序列

3.4.2HiTAIL-PCR扩增A1-139侧翼序列

3.5致病缺陷突变体A1-192和A1-139分析

3.5.1致病性测定

3.5.2A1-192、A1-139突变体的表型分析

3.5.3A1-192、A1-139突变体的T-DNA插入拷贝数

4讨论

小结

参考文献

致谢