雌激素缺乏对痴呆小鼠脑内糖代谢及学习记忆影响的机制研究

摘要

目的：研究雌激素缺乏不同时间段阿尔茨海默病（ Alzheimer ’s disease, AD）模型小鼠脑内糖代谢及学习记忆的改变，以明确雌激素缺乏促进AD发生发展的潜在分子机制。　　方法：对3月龄雌性APP/PS1双转基因小鼠和同月龄WT小鼠行双侧卵巢切除（ ovariectomy, OVX ）（ AD-OVX) ，以假手术AD小鼠(AD-Sham)为对照,同时设立正常野生型小鼠(WT-Sham)和(WT-OVX)为对照，于术后1周(模拟绝经早期)、术后1月(模拟绝经中期)和3月(模拟绝经晚期)，水迷宫实验（Morris water maze）检测OVX不同时间段对小鼠的空间学习记忆功能的影响；子宫称重法反映雌激素水平；免疫组织化学染色检测OVX对小鼠脑内病理特征老年斑以及神经元的影响；透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)检测小鼠海马区突触和线粒体的超微结构的改变；高尔基染色（Golgi-cox stain)检测小鼠海马树突棘的变化；2-fluoro-2-deoxy-d-glucose-positron emission tomography (FDG/PET)检测小鼠脑内糖代谢情况；采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测OVX对小鼠脑内芳香酶（aromatase）、葡萄糖转运蛋白(GLUT-1、GLUT-3)、突触相关蛋白(GAP43、PSD95)、mt-PDE1-α蛋白、能量代谢通路相关信号分子(mt-ERβ, IGF-1, IGF-1R, p-GSK-3β(ser9), GSK-3β)的表达变化。　　结果：OVX 1周，AD-OVX组小鼠子宫重量开始减轻，但无统计学意义；小鼠脑内芳香酶出现反应性增加的趋势；而OVX 1月和3月，在AD小鼠和WT小鼠中，手术组小鼠子宫明显萎缩，重量也显著减轻；脑内芳香酶表达呈下降趋势；免疫组织化学染色显示，OVX 1周和1月，各组小鼠脑内均未检测到老年斑；而OVX 3月，与AD-Sham组比较，AD-OVX组小鼠脑内出现大量老年斑的沉积，同时，在人脑组织中，绝经AD女性患者脑内有大量老年斑，其数量和面积都要显著多于对照组；接着检测海马区神经元的形态MAP2和成熟神经元NeuN蛋白的表达情况，OVX 1周，AD-OVX组与AD-Sham组比较， AD-OVX组小鼠脑内NeuN蛋白的表达呈升高趋势；而OVX后1月和3月，AD-OVX组小鼠脑内NeuN蛋白的表达呈显著下降趋势，WT小鼠手术组变化趋势与AD小鼠手术组一致；Morris水迷宫显示，在AD小鼠中，OVX 1周，AD-OVX组与AD-Sham组比较，其逃避潜伏期、搜索路径以及穿越平台的次数无明显差异，此时，与学习记忆相关的海马区突触以及突触前膜囊泡的数量、海马神经元胞体发出的树突及树突棘的数量无明显差异，海马突触活性区域长度以及突触相关蛋白(GAP43、PSD95)的表达有反应性增加趋势；而OVX 1月和3月， AD-OVX组小鼠找到平台的时间和搜索路径显著延长，穿越平台的次数也相应减少，与学习记忆相关的海马突触以及突触前膜囊泡的数量、突触活性区域长度以及突触相关蛋白(GAP43、PSD95)的表达、海马神经元胞体发出的树突及树突棘的数量呈减少趋势，WT小鼠手术组变化趋势与AD小鼠手术组一致；FDG-PET结果显示，AD小鼠与WT小鼠相比，其脑内葡萄糖摄取明显减少，OVX后1周，AD-OVX组小鼠脑内葡萄糖摄取较AD-Sham组有增加，相应地，小鼠脑内葡萄糖转运蛋白(GLUT-1、GLUT-3)有反应性增加趋势；而OVX 1月和3月， AD-OVX组小鼠脑内葡萄糖摄取减少，葡萄糖转运蛋白(GLUT-1、GLUT-3)表达也显著降低，WT小鼠手术组变化趋势与AD手术组一致；透射电镜和Western blot结果分别显示， OVX 1周， AD-OVX组与AD-Sham组比较，AD-OVX组小鼠海马区线粒体结构无明显变化，脑内mt-PDE1-α、mt-ERβ、IGF-1、IGF-1R、p-GSK-3β(ser9)表达呈应性增加的趋势；而OVX 1月和3月，AD-OVX组小鼠海马区线粒体出现轻重度水肿，脑内mt-PDE1-α、IGF-1、IGF-1R、p-GSK-3β(ser9)表达呈显著减少的趋势；有趣的是，OVX后3月，AD-OVX组小鼠脑内mt-ERβ蛋白表达有上调趋势。　　结论：双侧卵巢切除（OVX）可以很好的模拟绝经状态，雌激素缺乏早期小鼠脑内各项指标出现应激性代偿反应；但随着雌激素缺乏时间的延长，WT小鼠出现学习记忆和线粒体能量代谢的损害，加重了AD小鼠线粒体能量代谢以及学习记忆的功能和结构障碍，进一步加重了AD的病理特征，该作用可能是通过与能量代谢相关通路中异常表达的mt-ERβ介导的IGF-1/IGF-1R/GSK-3β信号通路相关。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1 材料与方法

1.1实验动物

1.2 人脑组织

1.3 主要实验仪器

1.4.1 主要试剂

1.4.2 试剂配方

1.5 实验方法与步骤

1.5.1 基因分型和鉴定

1.5.2 动物模型构建-卵巢切除术（OVX术）

1.5.3 Morris 水迷宫行为测试

1.5.4 标本制备

1.5.5 免疫组织化学染色

1.5.6透射电镜样品制备及观察

1.5.7 高尔基染色标本制备及染色(Golgi-cox stain)

1.5.8 PET

1.5.9 线粒体提取

1.6.0 蛋白水平半定量检测（Western blot)

1.6.1 统计学分析

2 结果

2.1 APP/PS1双转基因小鼠的鉴定

2.2 动物模型构建-卵巢切除术（OVX术）

2.3 雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠学习和记忆的动态变化

2.4 雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠子宫形态和脑内雌激素合成酶的变化

2.5 雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠脑内及AD患者脑内老年斑的变化

2.6雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠海马区突触的变化

2.7 雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠海马区树突棘的变化

2.8 雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠脑内神经元的变化

2.9雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠脑内糖代谢的变化

2.1.0 雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠脑内葡萄糖转运蛋白（GLUT-1,GLUT-3)的变化

2.1.1 雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠海马区线粒体超微结构和功能的变化

2.1.2 雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠脑内线粒体雌激素受体β(mt-ERβ)的变化

2.1.3 雌激素缺乏不同时间段APP/PS1小鼠脑内IGF-1, IGF-1R, GSK-3β的变化

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:雌激素与脑内糖代谢及学习记忆在AD中的相关研究

致谢

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