碳纳米材料对真菌产酶与酶脱色影响研究

摘要

碳纳米材料由于其良好的理化性质而被广泛运用，随之而来的就是其排入环境的量逐年增多，对环境有显著的影响。真菌具有产酶的能力，是目前生物降解污染物的重要研究对象。二者均大量存在于环境中，会发生接触与反应，为明确二者的相互作用和碳纳米材料与酶接触固定后对环境污染物质降解的影响。本文利用枝孢菌Cladosporiumsp. KR14，对其产胞外酶培养基进行优化，通过酶活性改变分析碳纳米材料对真菌的影响，并利用 3 碳纳米材料对 3 种胞外酶的吸附固定分析其在污染物降解方面的应用，主要结果如下：　　对枝孢菌Cladosporiumsp. KR14进行液体发酵产酶培养，得到其优化产酶条件：选用20g/L葡萄糖作为碳源，3 g/L(NH4)2SO4作为氮源为最佳碳氮组分及比例；培养基初始pH为5.4，接种量为10%，发酵温度为26℃为优化后最佳发酵条件，在此情况下可同时得到漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的最大产量。对所产酶的酶学性质作为研究得到：(a) 温度影响及稳定性：枝孢菌Cladosporium sp. KR14所产3种胞外酶漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶均在40℃下可得到最高酶活，分别为46.2 U/L、574.8 U/L和46.2 U/L且锰过氧化物酶的温度稳定性高于另外两种酶。(b) pH影响及稳定性：漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物最佳pH分别为：5、3.5和2.5，且木质素过氧化物酶对较高pH稳定性较低。　　3种碳纳米材料对枝孢菌Cladosporiumsp. KR14产酶具有不同程度的影响；30 mg/L及以下浓度碳纳米材料加入对枝孢菌Cladosporiumsp. KR14产酶均具有一定刺激作用，其中单壁碳纳米管效果最佳，当浓度高于30 mg/L后，酶活出现明显降低，对微生物产生毒性。相同浓度下氧化石墨烯对枝孢Cladosporiumsp. KR14的毒性最小。　　对枝孢菌Cladosporiumsp. KR14产酶进程进行分析，在14天内可得到酶活最高值。当培养基中存在木质素作为底物时，枝孢菌Cladosporiumsp. KR14会对其进行降解，碳纳米材料同样影响降解过程。当存在单壁碳纳米管时出现最高降解率45.9%，较对照增加12.7%，其次为石墨烯和氧化石墨烯。利用电化学研究其机理，得到碳纳米材料的加入可增加枝孢菌Cladosporiumsp. KR14与木质素底物之间的电子传递。对经过枝孢菌Cladosporiumsp. KR14降解的碳纳米材料进行XPS、FTIR和拉曼分析可知，枝孢菌Cladosporiumsp. KR14对碳纳米材料产生由催化引起的大量缺陷、空穴及不对称结构及无序性增加。　　漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶与单壁碳纳米管、石墨烯和氧化石墨烯吸附固定，其中单壁碳纳米管由于其表面结构，对于三种胞外酶的吸附量为3种材料最高，其漆酶吸附量达0.75 mg漆酶/ mg单壁碳纳米管。吸附后测定酶活性的变化，发现酶与碳纳米材料结合后其活性均有所上升，其中漆酶-碳纳米材料固定后酶活性变化较大，漆酶活性增加10.4 %。利用酶-碳纳米材料结合对染料进行脱色，漆酶对于酸性品红（三苯甲烷类染料）缺乏直接脱色能力，需要 ABTS作为介体进行脱色；锰过氧化物酶对于三种染料均需要Mn2+的加入才可进行有利脱色。利用酶-碳纳米材料吸附固定后，除去碳纳米材料吸附外，降解率均提高，漆酶-碳纳米材料结合后基本脱色率可达到90%，且其中单壁碳纳米管为最佳。

目录

1 绪 论

1.1 引言

1.2.1 碳纳米管

1.2.2 石墨烯及其衍生物

1.2.3 碳纳米材料的环境行为

1.2.4 碳纳米材料的生物降解

1.3 真菌发酵产酶

1.3.1 漆酶

1.3.2 锰过氧化物酶

1.3.3 木质素过氧化物酶

1.4.1 结合现状

1.4.2 酶与纳米材料的相互作用及相关的性质变化

1.4.3 碳纳米材料的酶固定化改善酶学性能

1.5 酶降解难降解污染物

1.5.1 木质素及其污染、降解现状

1.5.2 染料脱色

1.6.1 研究目的及意义

1.6.2 研究内容

1.6.3 技术路线

1.6.4 研究特色与创新之处

2Cladosporium sp. KR14产酶条件优化及酶学性质研究

2.1 引言

2.2.1 菌株

2.2.2 试剂

2.2.3 实验仪器

2.2.4 培养基

2.2.5 产酶实验

2.2.6 发酵培养基组分对Cladosporium sp. KR14产酶及蛋白的影响

2.2.7 枝孢菌Cladosporium sp.KR14所产酶的酶学性质研究

2.2.8 碳纳米材料对枝孢菌Cladosporium sp.KR14产酶的影响

2.2.9 测定方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 碳源对枝孢菌 Cladosporium sp.KR14产酶的影响

2.3.2 氮源对枝孢菌 Cladosporium sp.KR14的影响

2.3.3 发酵温度对Cladosporium sp.KR14对产酶的优化

2.3.4发酵液初始pH对枝孢菌Cladosporiumsp. KR14产酶的优化

2.3.5 种子培养基接种量对Cladosporium sp.KR14产酶的优化

2.2.7 枝孢菌 Cladosporium sp.KR14所产酶的酶学性质研究

2.3.8 三种碳纳米材料对枝孢菌 Cladosporium sp.KR14产酶的影响

2.4 本章小结

3 Cladosporium sp.KR14与碳纳米材料间的相互影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株和培养基

3.2.2 试剂

3.2.3 实验仪器与设备

3.2.4碳纳米材料对枝孢菌Cladosporiumsp. KR14产酶进程影响

3.2.5 碳纳米材料对枝孢菌 Cladosporium sp.KR14降解木质素影响

3.2.6 碳纳米材料的XPS、Raman及FTIR表征

3.2.7 电化学检测

3.2.8 测定方法

3.3.1枝孢菌Cladosporiumsp. KR14酶活及总蛋白含量结果分析

3.3.2枝孢菌Cladosporiumsp. KR14降解木质素分析

3.3.3 电化学检测分析

3.3.4 碳纳米材料反应前后XPS分析

3.3.5 碳纳米材料反应前后拉曼分析

3.3.6 碳纳米材料反应前后FTIR分析

3.4 本章小结

4 碳纳米材料强化非特异性酶对染料降解研究

4.1 引言

4.2.1 实验试剂与仪器

4.2.2 碳纳米材料吸附非特异性酶

4.2.3 碳纳米材料吸附酶的活力测定

4.2.4 合成染料的紫外光谱扫描

4.2.5 酶-碳纳米材料对染料的吸附

4.2.6 酶-碳纳米材料对三种不同染料脱色

4.3.1 碳纳米材料对非特异性酶的吸附

4.3.2 碳纳米材料吸附对酶活力的影响

4.3.3 染料结构与紫外可见光谱扫描

4.3.4 酶-纳米材料的脱色进程及效率

4.4 本章小结

5 结论与展望

5.1 研究结论

5.2 研究展望

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录

B. 作者在攻读学位期间取得的科研成果目录

C. 学位论文数据集

致谢