番茄中介体基因SlMed23的克隆和功能研究

摘要

中介体(Mediator Complex)是广泛存在于动物、植物和微生物中的一类多蛋白复合物，其空间构象由头部、中部、尾部和激酶模块构成，在真核生物的转录调控中发挥关键的桥梁作用。对植物中介体的研究多集中在拟南芥，比如控制胚胎的形成、芽分生组织的发育、影响开花时间、根毛生成等。此外，它还参与非生物胁迫的响应。番茄作为一种广泛种植的蔬菜作物，具有重要的经济价值。而且，它还是用于科学研究的模式植物。然而，干旱、高盐等不良环境对番茄的生长和产量造成极大的损害。目前对番茄中介体参与非生物胁迫响应的研究知之甚少，所以，对番茄抗性基因的深入探究显得至关重要。　　本研究利用生物信息学方法从番茄中筛选出 SlMed23 基因，构建沉默载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化至番茄，通过RNA干扰技术沉默该基因的表达。此后，通过qRT-PCR技术探究SlMed23在番茄各个生长发育时期的表达水平，并检测其相关发育时期的生理生化指标，以期对 SlMed23 基因参与番茄生长发育的调控和在非生物胁迫中的功能进行初步的探究。主要研究内容如下所示：　　①由生物进化树分析可得，番茄SlMed23基因和拟南芥AtMed23具有较高的同源性，通过比较二者的氨基酸序列，发现其相似性为 68.14%。对番茄 SlMed23的上游3000bp启动子序列分析发现，其含有多个高温胁迫、干旱胁迫、伤害胁迫以及茉莉酸响应有关的顺式作用元件。　　②SlMed23在野生型番茄全部组织中均有表达，其中在幼叶和花中表达量较高，并且其表达量随着果实的发育逐渐增加。此外，在干旱胁迫和盐胁迫的诱导下， SlMed23在番茄叶片中的表达呈现出差异性。对SlMed23响应外源激素的表达模式分析可得，其转录水平受到ABA、GA3和MeJA的诱导。　　③构建 SlMed23 沉默载体，利用农杆菌转化法转化番茄植株。观察沉默效率较高的幼苗的生长状况发现，与野生型相比，沉默植株第一胎花序下叶片的叶轴变短、叶片结构相对简单、叶缘缺刻变浅，但是其株高和叶片数量几乎不变。通过qRT-PCR技术检测相关基因的表达发现，与野生型相比，沉默植株中GA合成基因GA20ox2和GA3ox1的表达水平显著降低，GA降解基因GA2ox2的转录水平显著上调，GA响应基因GAST1的表达量受到抑制，信号抑制子GAI的转录水平下调；生长素合成基因ToFZY2的表达显著性降低，响应基因ARF7和ARF8的表达量显著下调，生长素极性运输相关基因PIN7和PIN8的转录水平也出现了显著性降低。此外，叶片极性发育基因KNOX1、KNOX2和LA的表达量与野生型相比明显下调。　　④与野生型番茄相比，沉默株系的果实在IMG和MG时期颜色更深，叶绿素含量显著增加，通过qRT-PCR技术检测叶绿素合成基因DCL和降解基因SGR的转录水平发现，RNAi植株DCL的表达量显著上调，SGR的表达量则呈显著性下调。　　⑤与野生型相比，转 SlMed23 番茄植株的花粉在体外萌发较少。因此，沉默SlMed23可能抑制花粉的发育。　　⑥沉默 SlMed23 增强了植株的抗盐能力。通过检测幼苗的失水率、相对含水量、叶绿素总含量和丙二醛含量发现，在处理0d时，沉默SlMed23植株的各项指标与野生型相比相差无几，而在7d和15 d，沉默株系具有较低的失水率、较高的相对含水量、较高的叶绿素总含量和较低的丙二醛含量。此外，通过qRT-PCR技术检测根中胁迫相关基因的表达发现，沉默株系中 Cat1、Cat2、APX1 和 PR1 的表达量显著性上调。探究转SlMed23番茄幼苗对盐的敏感度发现，0mM和100mM NaCl处理后，沉默株系的下胚轴与野生型相比没有明显区别，然而，在100mM NaCl处理下，与野生型相比，转 SlMed23 番茄幼苗的主根显著性增长。种子萌发实验结果表明，在0mM NaCl处理下，WT和RNAi大多数种子均能萌发，在40mM NaCl处理下，沉默株系种子萌发数量显著性上调，在60mM NaCl处理下，二者的萌发率均较低。　　⑦ABA处理结果表明，培养基中不含ABA时，WT和RNAi生长状况无明显差异，3μM和5μM ABA处理下，与野生型番茄相比，沉默SlMed23幼苗的下胚轴长、主根长和重量显著性下调。MeJA处理结果表明，培养基中不含 MeJA时， WT和RNAi的下胚轴和根长无明显差异，而在10μM、20μM和50μM MeJA 处理下，与野生型相比，RNAi株系主根和下胚轴较长，幼苗较重。　　综上，本文对番茄中介体基因 SlMed23 在植株的生长发育及高盐胁迫中的功能做了初步探索，为全面深入研究植物中介体的功能和培育新型抗性植株提供重要参考。

目录

缩略词表

1 绪 论

1.1中介体概述

1.1.1中介体的发现

1.1.2 中介体的结构及命名

1.1.3中介体在转录调控中的功能

1.1.4植物中介体的分布

1.1.5中介体对植物生长发育的调控及在非生物胁迫中的功能

1.2植物非生物胁迫研究进展

1.2.1植物非生物胁迫相关的信号通路

1.2.2植物在非生物胁迫下的代谢调控规律

1.3植物中介体在非生物胁迫调控中的功能研究

1.4课题的提出及研究意义

1.5.1研究目的

1.5.2研究内容

1.5.3技术路线

1.5.4创新点

2 SlMed23基因的生物信息学分析

2.1研究方法

2.2结果与分析

2.2.1 SlMed23的理化性质

2.2.2 SlMED23与其同源蛋白的进化树分析

2.2.3 SlMED23与AtMED23蛋白的序列比对分析

2.2.4 SlMed23的启动子元件分析

3 SlMed23基因的表达模式

3.1.1材料

3.1.2仪器设备

3.1.3 实验试剂

3.2实验方法

3.2.1番茄材料的处理及收集方法

3.2.2总RNA 的提取

3.2.3反转录

3.2.4实时荧光定量PCR

3.3结果分析

3.3.1番茄总RNA提取

3.3.2 SlMed23基因在番茄不同组织中的表达模式分析

3.3.3 SlMed23基因在高盐和干旱处理下的表达水平变化

3.3.4 SlMed23基因对不同激素的响应

4 培育SlMed23沉默番茄

4.1.1实验材料

4.1.2实验仪器和设备

4.1.3实验试剂

4.2实验方法

4.2.1提取基因组DNA

4.2.2克隆目的片段及验证

4.2.3构建SlMed23沉默载体

4.2.4 农杆菌结合转移及介导番茄转化

4.2.5培育SlMed23沉默番茄植株

4.2.6 阳性筛选及沉默效率鉴定

4.3结果与分析

4.3.1 克隆目的片段

4.3.2 构建沉默载体

4.3.3培育SlMed23沉默番茄植株

4.3.4阳性筛选及沉默效率鉴定

5 沉默SlMed23对番茄生长发育的影响

5.1.1材料

5.1.2试剂

5.1.3仪器和设备

5.2方法

5.2.1 测定沉默植株的形态指标

5.2.2叶绿素提取

5.2.3 果实成熟天数统计

5.2.4 花粉萌发率检测

5.2.5 表型相关基因检测

5.3 结果分析

5.3.1沉默SlMed23影响了番茄植株的形态

5.3.2沉默SlMed23影响了果实的发育

5.3.3 沉默SlMed23影响了花粉的发育

6 沉默SlMed23对盐胁迫和外源植物激素的响应

6.1.1材料

6.1.2试剂

6.1.3仪器和设备

6.2.1盐胁迫处理

6.2.2幼苗盐敏感度分析

6.2.3盐处理下种子的发芽率统计

6.2.4外源植物激素（ABA和MeJA）处理

6.3.1沉默SlMed23影响了番茄幼苗对盐胁迫的抗性

6.3.2沉默SlMed23影响了番茄幼苗对盐的敏感度

6.3.3沉默SlMed23影响了番茄种子的发芽率

6.3.4沉默SlMed23影响了番茄幼苗对外源植物激素（ABA和MeJA）的敏感性

7 讨 论

7.1中介体参与植物生长发育及对非生物胁迫的调控

7.2 SlMed23的表达模式分析

7.3沉默SlMed23对番茄植株发育的多重影响

7.4沉默SlMed23增加了耐盐性

7.5沉默SlMed23对ABA和MeJA的响应

8 结论与展望

8.1实验结论

8.2工作展望

参考文献

附录

A 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录

B 学位论文数据集

致谢