甜菜素类生物碱诱导K562白血病细胞分化凋亡的研究

摘要

本论文对商陆（PhytolaccaAmericanaL）果实中甜菜素类生物碱的主要成分的提取、分离纯化、结构确证、含量测定、诱导K562白血病细胞株凋亡分化体外活性进行了研究，结果如下：　　1、优化商陆果实红色素的超声提取工艺　　采用正交试验设计，用超声波法提取商陆果实红色素。结果表明，超声波法最佳提取工艺为提取时间为30min、固液比为1:4（g：mL）、pH值为3、提取2次。超声波提取法具有省时、简便、效率高等优点，适合大生产应用。　　2、筛选出大孔树脂分离商陆红色素的工艺　　对5种大孔树脂提取商陆红色素进行比较，考察经AB-8大孔树脂分离的条件以及分离后乙醇沉淀商陆红色素的最佳工艺条件。AB-8大孔树脂吸附商陆红色素效果最好，其最佳工艺条件为：吸附流速2.0mL/min、上样pH值为3、洗脱剂浓度为15％乙醇溶液、洗脱流速0.7mL/min；乙醇沉淀纯化商陆红色素的最佳工艺为：洗脱液浓缩50倍，浓缩液：乙醇为1:10，沉淀3次。经过AB-8大孔树脂提纯后，乙醇沉淀不仅能够除去大部分杂质，而且大大提高了商陆红色素的品质。　　3、SephadexLH-20纯化商陆红色素　　优选SephadexLH-20纯化商陆红色的工艺条件。其最佳工艺条件为：上样体积为5mL、线性流速为7.15cm/h、流动相pH值为3。SephadexLH-20不仅能够除去大部分杂质，而且大大提高了商陆红色素的品质。　　4、商陆红色素的pre-HPLC制备及HPLC分析　　从SephadexLH-20样品中分离纯化甜菜素，纯化甜菜素的半制备色谱条件为:半制备型色谱柱：CrestODSPN：Co218050-212250（5μm,21.2mm×250mm）流动相甲醇-水（0.5%甲酸）=18：82，流速10mL/min，柱温室温，SPD-M10A二极管阵列检测器，进样量2.0mL。分析甜菜素的色谱条件为：色谱柱SinoChromODS-Bp(5μm,4.6mm×150mm)，流动相0-30min10%-30%甲醇-水(0.5%甲酸)梯度、30-60min10%甲醇-水(0.5%甲酸)，流速1.0mL/min，柱温室温，SPD-M10A二极管阵列检测器，进样量10μL。　　5、甜菜素类化学成分的结构确证　　采用超声波提取、大孔吸附树脂、SephadexLH-20和制备液相色谱方法，分离得到1个化合物，经有机波谱（紫外吸收光谱、电喷雾质谱、核磁共振波谱）分析鉴定为甜菜苷。　　6、甜菜素含量测定方法　　筛选出了紫外可见光分光光度计法和高效液相色谱法同时测定甜菜素含量的方法。紫外可见光分光光度计法测定甜菜素含量，其结果显示，商陆果实红色素在0.01~0.05mg/mL范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系，回归方程为Y=0.00478X+0.00566，r=0.9995；色谱条件为：色谱柱SinoChromODS-Bp(5μm,4.6mm×150mm)，流动相0-30min10%-30%甲醇-水(0.5%甲酸)梯度、30-60min10%甲醇-水(0.5%甲酸)，流速1.0mL/min，柱温室温，SPD-M10A二极管阵列检测器，进样量10μL。结果显示，线性范围为：甜菜苷在6.00～22.00μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=1016425.225X+1824551.050，r=0.9996。该方法简便、可靠，适于甜菜素类成分的含量测定和质量控制。　　7、甜菜苷体外诱导K562白血病细胞株分化凋亡活性研究　　本文研究从商陆果实中分离出来的甜菜红色素甜菜苷抗人类白血病细胞株K562活性。结果表明，甜菜苷抑制K562白血病细胞的增值随浓度与时间成反比，药物作用24h、48h、72h的IC50分别为6.395、5.304、4.796μM。荧光显微镜和细胞形态学的进一步研究表明，甜菜苷作用K562细胞后有染色质浓缩、细胞收缩、细胞膜空化等细胞凋亡特征的出现。DNA碎片的凝胶电泳出现有规律的DNA梯形图，表明甜菜苷作用的细胞出现了凋亡。浓度1-10μM作用细胞，流式细胞仪分析细胞周期的变化发现细胞周期呈现G0/G1期阻滞，S期细胞数明显减少，并呈现出剂量依赖性；细胞表面抗原实验表明5.30μM的甜菜苷能诱导K562白血病细胞分化。

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1 绪 论

1.1 甜菜素类生物碱的提取、分离、纯化

1.2 甜菜素类生物碱结构

1.3 甜菜素类生物碱药理作用

1.4 药代动力学

1.5 小结与讨论

2 甜菜素类生物碱的提取、分离与纯化

2.1 优化商陆果实红色素超声波的提取工艺

2.2 筛选出AB-8大孔树脂提取分离商陆红色素的工艺

2.3 Sephadex LH-20纯化商陆红色素的研究

2.4 商陆红色素的pre-HPLC制备及HPLC分析

3 甜菜素类生物碱化学成分的结构确证

3.1 材料与仪器

3.2 结果与分析

3.3 小 结

4 含量测定方法

4.1 紫外分光光度计法测定商陆果实红色素含量

4.2 HPLC法测定商陆果实中甜菜苷的含量

5 甜菜苷诱导白血病细胞K562细胞株分化凋亡

5.1 材 料、仪器与试剂

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨 论

6 结论与展望

6.1 全文结论

6.2 展 望

致谢

参考文献

附录

个人简历、在学期间发表的学术论文