粉防己碱抗内毒素致炎症反应作用及机制研究

摘要

目的：通过建立LPS致大鼠发热模型和LPS致小鼠疼痛增敏模型，观察粉防己碱(Tetrandrine，Yet)减轻LPS诱导的动物发热和痛觉曾敏作用及其机制；观察Tet对LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的抗炎作用，并探讨可能的抗炎机制。 方法： 1．LPS 100μg·kg<'-1> ip建立大鼠发热模型，连续6小时监测大鼠体温变化，观察Tet相对于对乙酰氨基酚对LPS致大鼠发热的解热作用；运用Westemblotting技术检测肝脏及脑组织中环氧酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表达；试剂盒检测肝脏中髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、血液中前列腺素E<,2>(Prostaglandin E<,2>，PGE<,2>)的含量。 2．LPS 100μg·kg<'-1>ip建立小鼠疼痛增敏模型，分别用热板法和醋酸扭体法观察Tet相对于对乙酰氨基酚对疼痛增敏小鼠的镇痛作用；Westernblotting技术检测小鼠脑组织环氧酶(cyclooxygenase COX)-1、COX-2、COX-3的表达；ELISA试剂盒检测血浆中白细胞介素(interleukin IL)-6、IL-10、α一肿瘤坏死因子(α-tumour necrosisfactor,TNF-α)的含量。 3．LPS μg·ml<'-1>刺激生长良好的RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症模型。不同剂量Tet干预后，NF-κB P65核转位试剂盒检测P65核转位情况；Westernblotting技术检测细胞COX-2、iNOS的表达；ELISA试剂盒培养液中IL-6、IL-10、TNF-α和EIA试剂盒检测PGE<,2>的含量。 结果： 1．LPS 100μg·kg<'-1>，ip后，大鼠体温升高，最高超过正常2.5℃，并在LPS作用后0.5h、3h、6h左右各出现一个发热峰，与文献报道一致，说明建模成功。对乙酰氨基酚处理组动物体温升高不明显。Tet药物组不同程度降低LPS所致发热反应，大剂量组体温降到正常以下。Westernblotting技术显示模型组肝脏和脑组织中COX-2表达增加，同时肝脏中MPO上调，血液中PGE<,2>升高。Tet药物组动物肝脏及脑组织中COX-2蛋白则被不同程度抑制，同时肝脏中MPO的含量，血液中PGE<,2>的水平也相应降低。 2．LPS 100μg·kg<'-1> ip后，小鼠扭体反应次数明显增加，舔足时间提前，呈现出明显痛觉过敏表现。对乙酰氨基酚组可显著减少扭体反应次数和延长舔足时间。Tet药物组不同程度抑制扭体反应次数，延长热板实验的舔足阈，表现出良好镇痛效应。Westernblotting技术显示模型组脑组织中COX-2、COX-3表达增加，COX-1无变化，血浆IL-6、IL-10、TNF-α上调；Tet不同程度抑制COX-3表达，降低血浆IL-6、TNF-α，增加IL-10含量。 3．LPS 1μg·ml<'-1>干预RAW264.7细胞后，激光共聚焦显微镜下观察结果显示，红染的NF-κB P65亚基聚集于细胞核，使胞核红色荧光明显强于胞浆。同时细胞COX-2、iNOS蛋白表达增加，并伴有培养液中IL-6、TNF-α、IL-10、PGE<,2>上调。Tet药物组细胞胞核红染较弱，COX-2、iNOS表达不同程度下调，培养液中炎性细胞因子IL-6、TNF-α、PGE<,2>降低，抗炎细胞因子IL-10增加。 结论： 本实验结果显示：(1)Tet具有解热作用，其机制可能与其抑制肝脏和脑组织中COX-2的表达，降低肝脏组织MPO的含量，抑制发热介质PGE<,2>的表达有关；(2)Tet具有抗炎镇痛活性，其作用机制可能与其抑制中枢COX-3、血液中IL-6、TNF-α的产生，促进抗炎因子IL-10的表达有关；(3)Tet可以抑制LPS所致的RAW264.7巨噬细胞炎症反应，其抗炎机制与其抑制NF-κB P65核转位，下游炎性蛋白COX-2、iNOS的表达，和炎性细胞因子IL-6、TNF-α、PGE<,2>的产生有关；另外Tet还可促进抗炎细胞因子IL-10的表达，这可能是其发挥抗炎作用的又一原因。

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摘要

前言

第一部分：粉防己碱对脂多糖致大鼠发热的解热作用及机制

1.材料和方法

2.结果

3.讨论与结论

4.参考文献

第二部分：粉防己碱对脂多糖致小鼠的痛觉增敏的影响及机制

1材料与方法

2结果

3讨论与结论

4.参考文献

第三部分：粉防己碱对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症反应影响及机制

1材料和方法

2结果

3讨论与结论

4.参考文献

附图

文献综述：内毒素耐受机制的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文