异常球菌角蛋白酶的异源表达和羽毛降解特性研究

摘要

角蛋白(Keratin)是一类广泛存在于自然界的非营养型硬蛋白，主要分布在动物的皮毛、蹄甲部位，结构中含有大量氢键、半胱氨酸构成的二硫键，二硫键相互作用形成致密的角蛋白结构使其难以被降解利用。角蛋白酶（Keratianse）是一种可以特异性降解角蛋白的酶类，它能破坏羽毛角蛋白致密的结构达到降解的目的。为了更好的利用角蛋白和开发角蛋白酶基因本研究从戈壁异常球菌（Deinococcus gobiensis）I-0和耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)R1中鉴定了三个角蛋白酶基因，分别命名为Kerdg1（DGO_RS02895）、Kerdg2（DGO_RS03965）、Kerdr（A2G07_RS01950）,并在大肠杆菌中进行了异源表达和羽毛降解特性研究。主要结果如下：　　1、为了研究这三个基因，分析其序列结构发现Kerdg1由1239碱基组成可编码412个氨基酸残基，分子量为：41.1 kDa；Kerdg2由1599碱基组成编码532个氨基酸残基，分子量为：53.78 kDa；Kerdr由1599碱基组成编码532个氨基酸残基，分子量为：53.39 kDa。序列比对发现KerDG1、KerDG2、KerDR蛋白含有跨膜结构和前导肽。结构中信号肽（The signal peptide）、N端前肽（N-terminal pro-peptide）、成熟蛋白区（mature protease）、C端尾巴（C-terminal pro-peptide）这四个部分与peptidases_s8_s53 家族蛋白相似，此外成熟蛋白区都有3个主要的氨基酸残基（Asp、His、Ser）与已知的芽孢杆菌角蛋白酶（KerA）一致，确认三个基因是角蛋白基因。　　2、将这3个角蛋白基因分别连接到pET22b载体中，并转化到表达宿主BL21进行原核表达。对重组菌株进行降解能力分析，结果显示重组菌株对羽毛的降解作用明显。对重组菌株作用于羽毛后的产物进行检测，结果显示降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸。　　3、将重组菌株诱导表达，SDS-PAGE电泳分析结果显示在菌液中、菌体上清中均能获得目的蛋白。对角蛋白酶酶学性质进行研究发现KerDG1最适pH和温度是5.0和60℃，酶活3.5 U/mL。KerDG2的最适pH和温度是8.0和40℃，酶活是3.0 U/mL。KerDR 的最适pH和温度是7.0和40℃，酶活是3.0 U/mL。耐受性实验表明角蛋白酶能耐受一定的温度和pH。同时，还发现酶对金属离子和化学试剂也有一定的耐受性。

目录

声明

1绪论

1.1角蛋白简介

1.2.1角蛋白酶

1.2.2角蛋白酶来源和分类

1.2.3角蛋白酶的理化性质

1.2.4角蛋白酶分子生物学研究

1.2.5 检验角蛋白酶酶活的方法

1.3角蛋白酶的应用及发展

1.4本研究的目的和意义

1.5技术路线图

2 kerdg1、kerdg2、kerdr角蛋白酶的生物信息分析

2.1引言

2.2实验方法

2.2.1生物信息分析

2.3结果分析

2.3.1序列结构

2.3.2序列比对

2.4小结与讨论

3 重组菌株的构建及功能鉴定

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1菌株与载体

3.2.2培养基和主要试剂

3.2.3主要仪器和设备

3.2.4实验方法

3.3 结果分析

3.3.1 载体构建及鉴定

3.3.2 重组菌株功能鉴定

3.4 小结与讨论

4 角蛋白酶的表达及理化性质探究

4.1 引言

4.2材料与方法

4.2.1菌株与载体

4.2.2培养基和主要试剂

4.2.3 主要仪器和设备

4.3实验方法

4.3.1角蛋白酶在大肠杆菌中的表达及鉴定

4.3.2理化性质探究

4.3.3羽毛降解产物分析

4.4结果与分析

4.4.1角蛋白酶在大肠杆菌中的表达及鉴定

4.4.2理化性质探究

4.4.3羽毛降解产物分析

4.5小结与讨论

5结论

致谢

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果