miR-21靶向内源性脂蛋白受体相关蛋白6突变在非酒精性脂肪性肝病发病中的作用

摘要

目的：非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是以肝脏脂肪蓄积和异常脂质代谢为特征的慢性肝脏疾病。随着生活方式的全球转型，NAFLD患者人口急速上升，现已成为21世纪全球重要的公共健康问题之一，给社会带来了巨大的经济负担。近年来，大量研究已经显示NAFLD中微小RNA（microRNA，miRNA）谱发生改变，探索通过miRNA靶向治疗NAFLD及相关病变的新兴分子机制引起了研究者的注意。有研究报道，miR-21及低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein，LDL)受体相关蛋白6（LDL receptor-related protein6，LRP6）均参与NAFLD的发生、发展，但miR-21是否可以作为其治疗靶标以及miR-21与LRP6之间的关系均是未知的。在本研究中，使用NAFLD的体外细胞模型进行实验，以研究miR-21对脂质合成和分泌的影响，并确定miR-21对NAFLD发挥其作用的新靶标。　　方法：　　(1)使用软脂酸（Palmitic acid，PA）和油酸（Oleic acid，OA）（1：2）混合物（PA/OA）干预HepG2细胞建立NAFLD体外细胞模型。用siRNA技术沉默PA/OA干预后HepG2细胞中的miR-21表达，用miR-21 mimic或对照（control）mimic转染PA/OA干预后HepG2细胞使miR-21表达上调，然后监测miR-21对胆固醇（Cholesterol，C），胆固醇酯（Cholesteryl ester，CE），甘油三酯（Triglyceride，TG）和磷脂（Phospholipid，PL）合成和分泌的影响；　　(2)miR-21 mimic或controlmimic，miR-21 antagomir或control antagomir转染PA/OA干预后HepG2细胞分别上调和阻断miR-21的表达，检测LRP6表达；　　(3)实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹（western blot）分析检测参与脂质代谢的基因，包括肝脏X受体α（Liver X receptorα，LXRα），硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Stearoyl-CoA desaturase1， SCD1），乙酰辅酶A羧化酶1(Acetyl-CoA carboxylase1，ACC1)，和固醇调节元件结合蛋白1（Sterol regulatory element binding protein1，SREBP1）等，以及LRP6在mRNA和蛋白质水平的表达；　　(4)运行Target Scan程序，之后将LRP63’非翻译区(Untranslated area，UTR)或LRP6突变的3'-UTR克隆到荧光素酶报告基因载体中，LXRa3’-UTR克隆到荧光素酶报告基因载体作为阴性对照，之后分别与miR-21mimic或control mimic共转染PA/OA干预后HepG2细胞进行双荧光素酶报告基因检测，探讨miR-21表达水平对LRP6的影响。　　结果：　　(1)miR-21 mimic转染PA/OA干预后HepG2细胞可以使除了CE之外的脂类，包括C，TG，PL合成和分泌增加，实时荧光定量PCR显示miR-21表达上调可以诱导编码脂肪生成酶基因，包括ACC1，SCD1，SREBP1和LXRα等的表达增加；　　(2)miR-21 mimic转染PA/OA干预后的HepG2细胞，实时荧光定量PCR和western blot显示LRP6在mRNA和蛋白质水平表达降低。反之，miR-21 antagomir转染却使LRP6的表达水平增加；　　(3)运行Target Scan程序，显示LRP6为miR-21的潜在靶标。双荧光素酶报告基因检测显示，LRP63'-UTR和miR-21mimic共转染的细胞中荧光素酶活性显著降低，miR-21 mimic的转染对LRP6突变的3'-UTR和LXRa3’-UTR的荧光素酶活性没有任何影响。　　结论：miR-21在NAFLD的体外细胞模型中调节脂类代谢，该作用通过抑制LRP6的表达来实现。LRP6是miR-21的新靶标。miR-21可能是通过靶向内源性LRP6治疗NAFLD的新策略。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 miR-21 mimic转染增加脂肪生成

2 miR-21 mimic转染导致LRP6表达下调

3 阻断HepG2细胞miR-21表达导致LRP6表达增加

4 LRP6是miR-21的直接靶标

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:microRNA-2在非酒精性脂肪性肝病发病中的作用

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