α-干扰素联合全反式维甲酸逆转人白血病细胞K562/ADM耐药性的研究

摘要

目的：探讨α-干扰素（interferon-α，IFN-α）和全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）联合作用对耐药白血病细胞K562/ADM耐药性逆转效应及其作用机制。　　方法：　　1.采用CCK-8法检测K562/ADM对ADM的耐药性；　　2.采用CCK-8法检测IFN-α、ATRA、IFN-α+ATRA对K562/ADM细胞生长的影响；　　3.采用CCK-8法检测IFN-α、ATRA对K562/ADM细胞耐药逆转效应；　　4.流式细胞仪检测IFN-α、ATRA、IFN-α+ATRA对K562/ADM细胞凋亡的影响；　　5.流式细胞仪检测IFN-α、ATRA、IFN-α+ATRA对K562/ADM细胞周期变化的影响；　　6.RT-PCR法检测IFN-α、ATRA、IFN-α+ATRA对K562/ADM细胞PI3K、Akt、Bad基因表达的影响；　　7.Western blot法检测IFN-α、ATRA、IFN-α+ATRA对K562/ADM细胞PI3K、Akt、p-Akt、Bad蛋白表达的影响；　　8.统计学处理应用SPSS17.0软件进行统计处理，GraphPad Prism5软件绘图，数据用均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析、t检验及单因素方差分析等进行统计学分析，显著性水平以双侧P<0.05判断。　　结果：　　1.不同浓度的ADM单药作用K562/ADM细胞48h后的IC50为23.21±2.51（mg/L）而作用K562细胞的IC50为0.43±0.04（mg/L），依据公式计算，耐药倍数为54倍。　　2.IFN-α对K562/ADM及K562仅有轻微抑制作用，但相同剂量对上述细胞的增殖影响无统计学意义。ATRA对K562/ADM和K562细胞的IC50分别为（15.72±0.67）μmol/L、（14.26±0.54）μmol/L，二者差异无统计学意义(P>0.05)。CCK-8实验表明，IFN-α≤2.5×106U/L，ATRA≤7.5μmol/L时无明显毒性效应（对细胞的增殖抑制率<10％），因此选用IFN-α2.5×106U/L，ATRA7.5μmol/L为单独及联合用药时的干预浓度。　　3.IFN-α及ATRA单独及联用于K562/ADM时，ADM对K562/ADM细胞的IC50分别为IFN-α组18.76±2.71（mg/L）、ATRA组9.92±1.91（mg/L）、IFN-α+ATRA组2.85±1.21（mg/L），逆转倍数分别为1.24（P=0.001）、2.34(P=0.000)、8.14倍(P=0.000)。而对K562细胞IC50值并无明显影响。　　4.应用ADM4mg/L（IC50逆转浓度）单用或联合IFN-α2.5×106U/L、ATRA7.5μmol/L均可使 K562/ADM细胞的凋亡率明显增加，分别为12.58±1.88（%）、19.68±2.01（%）、38.65±2.99（%），联合组最为显著，较比照组4.21±1.40（%）相比，存在统计学差异(P=0.000)。　　5.IFN-α或ATRA或联合应用均可导致K562/ADM细胞周期产生G0/G1期停滞，从而控制细胞的生长，将G0/G1期百分比由对照组20±0.98（%）提升至36.13±1.69（%）、42.92±3.53（%）、51.89±2.65（%）。IFN-α联合ATRA效果较IFN-α、ATRA单用时明显增强，较K562/ADM组存在统计学意义（P<0.05）。　　6.PCR结果提示：IFN-α组、ATRA组、IFN-α联合ATRA组PI3K基因表达明显下调（均为P=0.000）。Akt基因无明显变化（P=0.08，P=0.052，P=0.592，均>0.05）。IFN-α单药并未引起Bad基因的显著改变（P=0.135），但ATRA及联合组都引起Bad基因上调（P=0.008，P=0.001）。　　7.Western blot结果与PCR结果一致，IFN-α、ATRA、IFN-α联合ATRA均可引起PI3K蛋白表达明显下调（均为P=0.000）。Akt基因无明显变化（分别为P=0.730，P=0.573，P=0.555，均>0.05）。磷酸化Akt蛋白表达下降，当两药联用时更为显著（分别为P=0.002，P=0.017，P=0.000）。IFN-α单药并未引起Bad基因的明显改变（P=0.054），但ATRA及联合组均引起Bad基因表达上调（P=0.000，P=0.000）。　　结论：　　1.IFN-α联合ATRA能引起 K562/ADM细胞凋亡，并且能够逆转K562/ADM细胞耐药。　　2.IFN-α、ATRA及联合用药可使K562/ADM细胞周期产生G0/G1期阻滞。　　3.IFN-α、ATRA及联合用药可经抑制PI3K/Akt信号通路及上调下游靶分子Bad而发挥增强K562/ADM细胞凋亡效应。

目录

前言

材料与方法

1 实验对象

2 实验试剂

3 主要实验仪器

4 试剂配制

5 实验步骤

6 实验方法

结果

1 α-干扰素联合全反式维甲酸对K562/ADM细胞的增殖及耐药影响

2 流式细胞术检测α-干扰素联合全反式维甲酸对K562/ADM细胞凋亡的影响

3 流式细胞术检测α-干扰素联合全反式维甲酸对K562/ADM细胞周期的影响

4 α-干扰素联合全反式维甲酸对K562/ADM细胞PI3K、Akt、Bad基因表达的影响

5 α-干扰素联合全反式维甲酸对K562/ADM细胞PI3K、Akt、P-Akt、Bad蛋白的影响

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:干扰素在髓系白血病中的应用进展

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