CX43蛋白磷酸化在大鼠逼尿肌过度活动症中的作用

摘要

目的:　　逼尿肌过度活动症(DO)是一种常见的临床疾病，其膀胱兴奋性通常高于正常膀胱。DO的主要症状是:尿急、尿频、伴有或者不伴有尿失禁。DO的发病机制仍不清楚，且治疗困难。膀胱出口部分梗阻(PBOO)是DO的主要病因，其机制可能涉及到神经源性和肌源性的因素。最近一些研究表明，细胞间通讯的改变被认为是DO发病的机制之一，CX43蛋白可能在DO的发病过程中发挥着关键作用。与正常组相比较，DO组的细胞间通讯的功能（Gap junction intercellular communication，GJIC）和CX43蛋白的表达都明显增加。　　CX43蛋白是一种磷蛋白，其磷酸化的状态会影响细胞间通讯功能。但是CX43蛋白的磷酸化在DO的发病过程中的作用仍然不清楚。　　在我们的试验中，我们通过建立DO模型来评价CX43蛋白的磷酸化在大鼠DO中的作用，并且初步探索蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)在CX43蛋白磷酸化中的作用。　　方法:　　1.建立DO模型:实验动物为60只雌性大鼠(150克-180克)。大鼠采用腹腔注射戊巴比妥钠(2％)进行麻醉，其中40只进行膀胱出口梗阻的手术。6周后，通过尿动力学评估筛选合格的大鼠纳入到DO组。假手术组的大鼠被纳入到正常组。　　2.Western bloting:提取蛋白。然后蛋白(50ug)通过SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移到纤维素膜上。用5％的BSA对膜进行封闭。孵育CX43多克隆抗体、PP1抗体、PP2抗体和β-actin的一抗。然后孵育结合有辣根过氧化酶的二抗。通过ChemiDoc XRS+Image系统显示标记过的蛋白。　　3.免疫荧光双染:将膀胱组织做冰冻切片，切好的组织粘附在防脱片载玻片上，4％的多聚甲醛(PH7.4)固定30分钟。组织切片用1％胎牛血清白蛋白在室温情况下封闭2小时，然后4℃孵育CX43单克隆抗体、CX43多克隆抗体、PP1抗体和PP2A抗体12小时。PBS清洗后，室温下孵育结合有异硫氰酸四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamineisothiocyanate， TRITC)和异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)的二抗1小时。PBS清洗切片。然后用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)室温下染核10分钟。最后组织切片用激光共聚焦显微镜检测。　　4.分离原代膀胱平滑肌细胞:将取出的膀胱放入37℃的消化酶(5ml)中，剪成约1毫米的碎块。消化酶的成分为:2.0mg/ml的胶原酶Ⅱ、2.0mg/ml的BSA，2.0mg/ml的胰酶抑制剂。碎块消化约35分钟，然后用含10％胎牛血清的培养基终止消化。离心5分钟（1200转/分钟），弃上清。加入含DMEM、10％胎牛血清和1％链霉素-青霉素的培养基。滴管吹打约300次.200目筛子(0.22um)过滤细胞，然后将滤液转入小培养皿中。细胞放入孵箱（37℃，95％O2和5％ CO2）中培养。　　5.荧光漂白恢复实验（Fluorescent bleaching recovery experiments，FRAP）:将贴壁好的细胞用PBS清洗一遍，然后把含有6-羧基二乙酸荧光素(6-Carboxyfluorescein diacetate，6-CFDA;10U/ml)的培养基加入到小皿中对细胞进行染色。孵箱中染色30分钟，而后PBS清洗三次。正常组和DO组加入正常的培养基，DO+AP组加入含碱性磷酸酶(AP)的培养基。选择合适的细胞进行淬灭。实时记录漂白前和漂白后5分钟的影像图片。　　结果:　　1.成功的建立了DO模型。共23只大鼠被纳入到了DO组;　　2.与正常组相比较，CX43蛋白的各个亚基的表达均明显增加，PP2A的表达降低，PP1的表达没有明显变化;　　3.DO组细胞间通讯的功能明显强于正常组，DO+AP组的细胞间通讯的功能明显低于正常组和DO组。　　结论:　　1.CX43蛋白磷酸化水平的增加在DO的发病过程中发挥着重要的作用;　　2.这种CX43蛋白的磷酸化水平的增加可能与PP2A表达的降低有关。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 建立DO模型

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 检测CX43、PP1和PP2A的表达

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

第四章 免疫荧光双染验证CX43、PP1和PP2A蛋白的表达变化并进行定位

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 结论

第五章 急性酶分离法获得大鼠原代平滑肌细胞

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 讨论

5．4 结论

第六章 荧光漂白恢复实验检测各组细胞间通讯的功能

6．1 材料与方法

6．2 结果

6．3 讨论

6．4 结论

全文总结

参考文献

文献综述

硕士在读期间以第一作者发表的论文情况

致谢