ppGpp在铜绿假单胞菌毒力及致病性调控中的作用研究

摘要

铜绿假单胞菌（PA）是一类广泛分布于自然界的革兰阴性条件致病菌，可感染人类、动物、植物等宿主，尤其易感免疫缺陷的患者，在临床上引发一系列急、慢性感染，有较高的发病率和死亡率。近年来，各种抗生素类药物的滥用导致了多重耐药铜绿假单胞菌的频现，细菌快速的突变、现存抗生素的失效以及新药开发的滞后，均为临床上相关感染的防控与治疗带来了很大的挑战。因此，深入研究并阐明铜绿假单胞菌的毒力系统及致病机理，将为该菌的感染防治提供理论基础。　　毒力和侵袭力是细菌致病的重要因素，铜绿假单胞菌可分泌产生绿脓素、绿色荧光素、弹性蛋白酶、内毒素A、磷脂酶C等，并可在定植体表面分泌藻酸盐等多糖粘液类物质，形成生物膜，从而增加细菌对抗生素及机体免疫防御系统的耐受力。此外，为了快速感知和适应不断变化的生存环境，细菌利用复杂的调控系统启动相关基因的表达和细胞间的信号通路，对环境变化作出群体性调整。细菌的应激反应存在一系列保守的调控系统，其中以胞内 GDP/GTP衍生物四磷酸/五磷酸鸟嘌呤核苷分子[(p)ppGpp]作为信号分子，可有效应对营养胁迫或环境压力。大部分革兰阴性菌的胞内ppGpp水平受合成酶RelA和双功能（同时具有合成和分解功能）SpoT酶的共同调控，在氨基酸、碳源、磷源饥饿或氧化压力等不利生长条件下被大量诱导合成，在转录水平调控各类基因的表达。相关研究表明，由ppGpp分子介导的应激反应可显著影响铜绿假单胞菌的生长、毒力、压力应激等，但相关的作用途径和具体的作用机制研究尚少。因此，深入研究和探讨ppGpp对铜绿假单胞菌毒力因子的影响及可能的作用机制，对于临床上PA感染的防治具有潜在重要意义。　　本研究利用同源重组技术，由铜绿假单胞菌野生型PAO1菌株构建了relA/spoT双基因敲除株（ΔRS）及其回补株（ΔRS++），检测发现ΔRS株的ppGpp合成能力完全缺失；为了探究这种胞内核苷分子在细菌毒力和致病中所发挥的作用，分别进行小鼠急性肺感染和细胞感染实验，发现ΔRS株毒力显著降低；进一步检测各类胞外毒力因子的分泌情况，发现ΔRS株的绿脓素、绿色荧光素、弹性蛋白酶等毒力因子合成和分泌能力显著降低；与此同时，ΔRS株与定植和慢性感染相关的生物膜形成能力也受到抑制。在此基础上，我们进一步发现ppGpp对毒力因子的调控是一种群体感应喹诺酮信号分子依赖的途径。本研究初步揭示了铜绿假单胞菌ppGpp分子对于毒力调控的重要意义，并对可能的调控机制作了一些探索，研究结果为认识铜绿假单胞菌毒力和致病性调控机制提供了新的数据参考。

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缩略语表

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第一章 前言

1.1 选题缘由

1.2 研究背景

1.3 研究意义

1.4 研究内容与方法

第二章 铜绿假单胞菌ΔRS株的构建

2.1 铜绿假单胞菌ΔRS株的构建

2.2 铜绿假单胞菌ΔRS株ppGpp的检测

第三章 铜绿假单胞菌ΔRS株的毒力因子检测

3.1 Ⅲ型分泌系统的检测

3.2 生物膜形成能力的检测

3.3 集群运动能力的检测

3.4 其他胞外毒力因子的检测

3.5 细菌毒力基因的表达水平检测

第四章 铜绿假单胞菌ΔRS株的致病性研究

4.1 铜绿假单胞菌ΔRS株在小鼠肺部感染模型中致病性的改变

4.2 铜绿假单胞菌ΔRS株细胞毒力的改变

第五章 ppGpp调控铜绿假单胞菌毒力的部分机制探讨

5.1 群体感应系统PQS信号分子的检测

5.2 外源性PQS对ΔRS株毒力因子的影响

全文总结

参考文献

文献综述:ppGpp调控铜绿假单胞菌毒力的研究进展

攻读学位期间发表的论文

致谢