幽门螺杆菌的基因多态性和适应性定植的微进化研究

摘要

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种螺旋状、微需氧的革兰阴性杆菌，属于螺杆菌属，定植于人胃黏膜表面。人类是其唯一的天然宿主，现已证实其感染与慢性胃炎、消化性溃疡和胃黏膜相关组织淋巴瘤(MALT)的发生密切相关。幽门螺杆菌的致病性主要与细菌的毒力因子和机体的遗传易感性两者密切相关。人类对H.pylori普遍易感，但不同个体感染后的症状轻重各不相同，表现出明显的致病性差异，轻者可长期无症状携带，重者可发展为慢性胃炎、溃疡甚至胃部肿瘤。其原因与菌株型别的毒力强弱相关，和宿主的遗传易感性也有紧密的相关性，从而导致了H.pylori的感染致病存在人种、地域、环境卫生、营养等显著差异性。　　 H.pylori和人类的共同进化至少可以追溯到人类刚走出非洲时的58000年前；H.pylori在与人类宿主的长期共存中，其基因组也经历了长时间的进化选择，细菌在进化的过程中通过自然突变、转导和转化等方式发生遗传物质的改变，而引起性状(定植能力、毒力、耐药性等)的改变，因此从分子水平对H.pylori菌株的流行病学和菌株多态性进行研究，观察其分子变异与菌群表型的关系，有助于我们确定不同地区感染H.pylori的主要菌型，了解其遗传背景和可能的来源，使得流行病学研究可以从表型特征的鉴别深入到基因特征的鉴定，探索基因在核酸水平的变化过程。　　 本文主要对H.pylori 公认的5个毒力相关因子的多态性及其在不同地域和疾病来源菌群中的分布进行了分析，包括cagA，vacA，babA，dupA和iceA。同时从管家基因的角度，应用MLST 系统对不同来源的H.pylori菌株进行基因水平的分型。此外，通过稳定的H.pylori 沙鼠定植模型，对H.pylori菌株的适应性定植的微进化机制进行了初步的探讨，以期能为H.pylori的适应性定植的生理学变化和定植机制的认识提供理论依据，从而为进一步研究H.pylori的致病机制打下基础。　　 主要完成了以下工作：　　 1.H.pylori 相关毒力因子的多态性分析：　　 对122株H.pylori菌株(慢性胃炎患者47例，十二指肠溃疡15株，胃溃疡25例，萎缩性胃炎19株和胃癌15株；并包括了汉族、蒙族和藏族等5个不同的族群)，基因组的vacA、CagA-EPIYA、iceA、dupA和定植因子babA 进行了特异引物PCR检测和分析，结果：babA2基因的总阳性率为83.7％。icecA1基因型的总阳性率73.9％，dupA的总阳性率为40.5％。vacA基因，信号区s 检出vacA s1a 阳性119株(97.5％)、s1b 阳性3株(2.5％)，s1c 阳性108株(88.5％)；而middle region的2种基因型检出率差异不大，m1型在胃癌的所占比例较高，占73.3％。对CagA 羧基端可变区氨基酸序列的分型，66.3％的菌株序列为含有3个EPIYA基序，其中主要以东亚型(EastAsian type)为主，占89.5％(85/95)。本研究中，中国H.pylori菌株70％均表现为vacA s1a/s1c+、babA2+、iceA1+、CagA-ABD型。不同分离来源菌株的主要CagA type序列型有所差异：在西藏，含4个(包括5个)和以上EPIYA基序的菌株占了西藏分离株的66.7％(30/45),同时这类序列型也只出现在西藏分离株中；而来源于蒙族的H.pylori有60％为CagA-西方型菌株。90.5％的藏族来源菌株均含有4个或以上EPIYA基序，这可能是藏族H.pylori菌株的一个特征标志，而这一特征性的CagA-EPIYA序列型，可能是西藏地区，特别是藏族人群高H.pylori感染率和胃癌发病率发生的基础。因此，H.pylori菌株在不同地域有其主要分布的基因型。　　 2.毒力相关因子间的关系：　　 76.8％的m1型菌株带有iceA1基因型，除西藏外的其他分离地点，m1型H.pylori菌株均为iceA1型；而基因型iceA2菌株除西藏分离株外，均为vacA m2型阳性。可见iceA1型与vacA m1型也有一定的相关性，但是这种协同作用需要考虑到地区差异性，如在西藏分离菌株的iceA2检出率明显高于其他地点。对于CagA分型为西方型的菌株，90％为vacA m2，50％带有babA2和iceA2基因；可见毒力较弱的西方型菌株，大多携带vacA m2和iceA2基因，而且babA2型的检出率也较低。而含有4个和4个以上EPIYA基序的菌株，96.7％带有vacA m1和babA2，70％表现为iceA1型。而东亚型ABD中，54％的菌株为m1型，在含有4个和以上EPIYA基序的菌株中只有3.6％的表现为m2型。这也证实了在毒力因子之间的存在一定的关联性。 3.MLST分析：　　 PCR 测定分析了atpA，efp，mutY，ppa，trpC，ureI和yphC，7个管家基因的目的核酸片段。使用BURST 程序可根据等位基因图谱将菌株所分为3组，其余STs序列型属于独特型(singletons)。对于西藏分离株来说，此群的核心菌株可能是ST2237；而在内蒙古地区，菌株与标准株与国外来源的西方菌株的联系更为明显。　　 4.H.pylori 适应株的SNP分析和鉴定：　　 从稳定的H.pylori 定植沙鼠模型中分离得到不同定植时期的H.pylori菌株，通过全基因组测序，采用SOAPsnp 方法分析初步筛选出了适应株的61个与定植相关SNPs位点，且主要分布在10个基因位点中。通过PCR和测序方法进一步验证发现，其中的SNPA 变异所在的黏附素AlpB蛋白的Asn130-Gly150结构域与H.pylori 适应性定植密切相关。对此位点进行了聚类分析发现，不同来源的30株H.pylori 可以被分为2群。该位点不仅在适应株中发生了较大的变异，在临床菌株中也存在明显的多态性。这可能是因为菌株定植于不同宿主，为了适应不同的胃部微环境，AlpB 发生了不同的变异，形成了这段结构域的多态性；这可能会是H.pylori菌株一个新的分型位点。　　 结论：　　 本研究针对H.pylori基因组的5种主要的毒力因子，对中国不同来源菌株进行了多态性的分析，中国H.pylori菌株的基因型主要为：vacA s1a/s1c/m2+；babA2+；iceA1+；CagA-ABD型。西藏分离株菌型特点为：cagA 3’端可变区的氨基酸序列主要含有4个或4个以上EPIYA基序；而藏族H.pylori菌株vacA s1a/s1c/m1阳性率均高于中国其他地区。蒙族H.pylori菌株，出现m2型，dupA+,和CagA-西方型的几率高于其他族群，提示这群H.pylori可能和藏族菌株有着相反的疾病发展谱。MLST分析菌株结果均为新的序列型，反映了细菌高度的多态性；系统进化发现蒙族菌株与西方型H.pylori菌株有着遗传相关性。对H.pylori 适应性定植的微进化分析， 发现黏附素AlpB蛋白的Asn130-Gly150结构域与H.pylori适应性定植密切相关；不同来源的人源性H.pylori菌株基因组在Asn130-Gly150结构域也有不同程度的变异，可能与不同菌株的适应性定植能力的差异有关。　　 上述研究工作为建立我国H.pylori菌株基因信息库提供了数据，同时为研究中国特征性H.pylori菌群的分子进化和流行规律、筛选与相关表型联系的靶基因位点提供了有利的线索和依据，为下一步建立进化模型，研究适应性机制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前言

第一部分幽门螺杆菌主要毒力因子的多态性分析

第二部分幽门螺杆菌的多位点序列分型(MLST)

第三部分幽门螺杆菌适应性定植的微进化研究

全文总结

本研究的不足和展望

致谢

参考文献

附图

文献综述 幽门螺杆菌的基因组多态性与适应性进化的研究进展

攻读博士学位期间发表的文章