超敏C反应蛋白单克隆抗体制备及其电化学免疫传感器的初步研究

摘要

CRP(C-reactiveprotein，CRP)是由Tillet和Francis在1930首先发现，相对分子质量为115，000-140，000的血清β球蛋白，因其能与肺炎链球菌细胞壁的C多糖起沉淀反应而命名。CRP被认为是一种急性时相反应蛋白，在临床上常作为急性炎症与细菌感染的诊断指标。早先基于免疫透射比浊和免疫散射比浊检测方法仅能检测到浓度为5mg/L以上的CRP，灵敏度较低。随着检测技术的不断发展，CRP检测能力大大提高，利用超敏检测方法可检测出低水平(0.1～10mg/L)的CRP浓度，我们称为超敏CRP(hypersensitiveC-reactiveprotein，hs-CRP)。研究表明hs-CRP与AS等心血管疾病的发生密切相关，被认为是心血管疾病的独立危险因素。目前，检测hs-CRP的试剂盒及其关键原料-特异高效的抗CRP单克隆抗体主要依赖进口，价格昂贵，不利于临床推广。因此，制备特异高效的抗hs-CRP单克隆抗体并建立稳定成熟的免疫检测体系具有良好的社会价值和经济前景。近年来，基于免疫技术与电化学检测相结合的免疫传感器技术也有了长足发展，其不但能定量分析，而且可能开发出适合社区医院应用的POCT快速检测产品，倍受关注。为了提高的生物传感器灵敏度，国内外一些学者采用不同的标记物来标记抗原或者抗体分子，在标记物中除了最常用的酶以外，G-四链体-hemin-DNA酶的研究越来越受到人们的关注，在该类酶的基础上，开发了一系列的高灵敏，高特异性的新型传感器。本研究中，我们制备了抗CRP单克隆抗体并建立起ELISA免疫检测体系，并在此基础上进行其电化学免疫传感器的研究。　　主要研究内容与结果：　　1.重组CRP的原核表达与纯化　　从NCBI核酸数据库中获得人CRP编码序列进行密码子偏性改造分析并进行全基因合成，利用E.coli表达系统表达CRP重组蛋白rhCRP28a和rhCRP22b，并经蛋白质浓度检测，SDS-PAGE鉴定和Western-blot鉴定，结果表明我们所制备的重组蛋白纯度大于90％，能与商用抗CRP抗体特异结合，可作为单克隆抗体制备的免疫原，筛选原与免疫检测的标准品。　　2.抗人CRP单克隆抗体的制备及其免疫检测体系的建立　　用我们制备的重组蛋白rhCRP22b作为免疫原免疫Balb/c小鼠，获得了5株CRP单克隆抗体，筛选得到两株单克隆抗体2-A6与2-E11可用于hs-CRP的ELISA免疫检测。通过鉴定两株抗体效价大于1∶2.56×105，亲和力达到109以上。ELISA检测系统线性范围为7.2-166ng/ml，灵敏度为5.2ng/ml，批内CV≤6.43％，批间CV≤5.93％，平均回收率为98.9％，与芬兰Orion公司hs-CRP诊断试剂检测结果有良好的可比性。　　3.超敏CRP电化学免疫传感器初步研究　　使用本实验室制备的可用于检测CRP的抗体配对2-A6与2-E11，将G-四链体-hemin-DNA酶修饰在二抗2-E11上，并加入DNA的富集步骤，成功制备了用于检测CRP的夹心式电化学免疫传感器。并对该免疫传感器的的线性检测范围与特异性进行初步的研究，结果表明该免疫传感器在0.1pg-100ng/ml的浓度范围内，电流信号与CRP抗原浓度的对数成正比关系，线性方程为Ia=13.9-1.861lgC(R2=0.99776)，选择性研究证明该免疫传感器对所选定的干扰物CEA和AFP无响应，具有较高的灵敏度与特异性，为进一步免疫传感器的研发奠定了基础。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章前言

1．1 选题缘由

1．2 研究背景

1．3 研究意义

1．4 研究内容

1．5 研究方法

第二章 CRP的原核表达、纯化与鉴定

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 抗CRP单克隆抗体的制备、鉴定及其免疫检测体系的初步建立和评价

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 CRP电化学免疫传感器的初步研究

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 C反应蛋白的临床应用进展

攻读学位期间的研究成果

致谢