基因枪法介导拟南芥AtMYB44基因转化小麦的研究

摘要

普通小麦（TriticumaestivumL.）是禾谷类家族中最为重要的成员之一，是全球总产量最多、种植面积最广的粮食作物。在世界粮食问题日趋严重的今天，提高小麦的产量和品质对缓解粮食短缺问题具有重要的实际意义。目前，利用基因工程技术的手段对小麦进行遗传改良，提高小麦的产量、改善小麦的品质、增强小麦对病虫害以及各种非生物胁迫的抵抗性，是小麦遗传育种中十分重要的发展方向。
　　 基因枪法是小麦遗传转化中最为广泛使用的一种方法，它具有无宿主限制、靶受体类型广泛、可控度高、操作简便快捷等优点。本研究采用基因枪转化法，将具有抗旱、抗寒及耐盐功能的拟南芥AtMYB44基因转入小麦品种扬麦158中，主要研究结果如下:
　　 1.建立并优化了扬麦158的高效再生体系。
　　 通过添加2,4-D浓度的梯度实验，发现在诱导培养基中添加2,4-D的浓度为2mg·L-1时，小麦幼胚的愈伤出愈率为最高的100％，且诱导出的愈伤组织较为致密，颜色为淡黄色，长势旺盛。通过添加不同浓度KT、IAA配比的比较实验，发现在分化培养基中激素添加为KT1.0mg.L-1和IAA0.5mg.L-1时，愈伤组织的分化率为最高的93.3％，且绿点数及丛生芽数都相比较高。最终确定本研究中愈伤诱导培养基为MS+2mg/L2，4-D;分化培养基为MS+1.0mg/LKT+0.5mg/LIAA。
　　 2.利用绿色荧光蛋白基因(GFP)作为标记基因，对基因枪的主要参数（轰击距离和钨粉/DNA用量）进行了优化。
　　 结果表明轰击距离为8cm时，GFP的瞬时表达率为最高的37.1％，且平均荧光细胞数也为最多的13.5个;钨粉/DNA用量为600μg/1μg时，GFP的瞬时表达率为最高的35.4％，且平均荧光细胞数也为最多的12.8个。最终确定了针对扬麦158幼胚愈伤组织的基因枪转化最佳轰击条件:轰击距离为8cm，钨粉/DNA的用量为600μg/1μg，氦气压力为7.5MPa，破裂膜为7MPa，真空度为0.095MPa，钨粉直径1μm。
　　 3.用基因枪法将拟南芥的AtMYB44基因导入到扬麦158中，获得了转基因植株，目的基因转化率为0.67％。
　　 本研究中共轰击了1044块愈伤组织，经过分化培养产生绿点的愈伤组织数为314块，经过生根壮苗培养，再生植株数为297株，其分化率和成苗率为分别为30.1％和28.4％;经过炼苗，越夏处理，将再生植株全部移栽到实验田中，最终成活了198株再生植株(To)，其移栽成活率为66％。提取再生植株的基因组DNA，分别对目的基因AtMYB44和选择标记基因Bar进行PCR检测，发现有7株再生植株的PCR检测结果呈阳性，并将目的基因AtMYB44的PCR产物片段进行克隆测序，结果比对正确，最终获得了7株转基因小麦植株。
　　 4.对转基因小麦其中一个株系M-141的7株T1代植株进行了PCR检测，结果显示7株均扩增出预期大小的DNA条带。
　　 本研究通过基因枪法将目的基因转入到小麦品种扬麦158的愈伤组织，经抗性筛选、分化再生得到再生植株，对再生植株(To)和转基因植株的后代(T1)用PCR方法进行了鉴定，结果表明已获得转AtMYB44基因的小麦植株，为进一步对AtMYB44基因在小麦中的功能表达、转基因小麦的抗逆性等研究奠定了基础。通过进一步的田间遗传稳定性、田间抗性等研究，从中筛选出具有较强抗旱、抗寒和耐盐碱的转基因植株，对小麦的南麦北种、提高盐碱滩涂耕地的利用率，以及提高小麦的总产量将具有重要的意义。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 文献综述

第一章 小麦转基因技术研究进展

1 小麦转基因技术研究概况

2 小麦遗传转化受体系统的建立

3 小麦遗传转化的主要方法

第二章 MYB类转录因子的研究就进展

1 MYB转录因子的结构特征与分析

2 MYB转录因子的生物学功能

3 MYB类转录因子的自身调控

4 AtMYB44基因的研究进展

5 本文研究的目的及意义

第二部分 研究报告

第一章 扬麦158组织培养体系及其基因枪转化条件的优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二章 小麦转拟南芥AtMYB-44基因的遗传转化研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 全文结论

附录

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢