弓形虫PLP1基因缺失株的构建及其生物学功能研究

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主要符号对照表

第一章 绪论

1.1 弓形虫及弓形虫病概述

1.1.1 弓形虫与弓形虫病

1.1.2 弓形虫分型

1.1.3 弓形虫生活史及传播方式

1.2 弓形虫的入侵研究进展

1.2.1 微线体蛋白在弓形虫入侵中的作用

1.2.2 棒状体蛋白在弓形虫入侵中的作用

1.2.3 致密颗粒蛋白弓形虫入侵中的作用

1.3 弓形虫的逸出宿主细胞研究进展

1.3.1 微线体蛋白弓形虫逸出中的作用

1.3.2 致密颗粒蛋白弓形虫逸出中的作用

1.4 弓形虫CDPK1研究进展

1.5 弓形虫PLP1研究进展

1.6 CRISPR/Cas9基因敲除技术

1.6.1 CRISPR/Cas系统简介

1.6.2 CRISPR/Cas9系统简介

1.6.3 CRISPR/Cas9在弓形虫中的应用

1.7 本研究的意义

第二章 蛋白表达及多克隆抗体制备

2.1 材料

2.1.1 试验动物与微生物

2.1.2 试剂与耗材

2.1.3 试验仪器

2.1.4 主要试剂及其配制

2.2 方法

2.2.1 蛋白表达的引物设计与合成

2.2.2 弓形虫的复苏及cDNA的合成

2.2.3 目的基因的扩增

2.2.4 目的片段与载体的双酶切及鉴定

2.2.5 重组质粒的连接及鉴定

2.2.6 重组质粒在大肠杆菌内的诱导表达

2.2.7 重组蛋白的纯化

2.2.8 多克隆抗体制备

2.2.9 Western-blot分析

2.2.10 间接免疫荧光试验（IFA）分析

2.2.10 重组蛋白CDPK1小鼠免疫保护试验

2.3 结果与分析

2.3.1 目的片段的扩增

2.3.2 重组质粒的鉴定

2.3.3 重组蛋白的表达及可溶性分析

2.3.4 重组蛋白纯化后SDS-PAGE分析

2.3.5 重组蛋白的Western-blot分析

2.3.6 IFA分析

2.3.7 重组蛋白CDPK1小鼠免疫保护试验

2.4 讨论

第三章 PLP1基因缺失株及互补株的构建

3.1材料

3.1.1 试验动物与微生物

3.1.2 试剂与耗材

3.1.3 试验仪器

3.1.4 主要试剂及其配制

3.2 方法

3.2.1 Vero细胞的培养

3.2.2 gRNA设计

3.2.3 pSAG1::CAS9-U6::sgPLP1敲除质粒和同源重组质粒pPLP1::DHFR-D的构建

3.2.4 弓形虫PLP1基因缺失株的构建及PCR鉴定

3.2.5 PLP1基因互补株质粒的构建

3.2.6 PLP1基因敲除后互补株的构建及PCR鉴定

3.2.7 PLP1基因缺失株及互补株的Western-blot分析

3.3 结果与分析

3.3.1 目的片段的扩增

3.3.2 质粒鉴定

3.3.3 PLP1缺失株及互补株的PCR鉴定

3.3.4 Western-blot分析

3.4 讨论

第四章 PLP1缺失株生物学功能研究

4.1 材料

4.1.1 试验动物与微生物

4.1.2 试剂与耗材

4.1.3 试验仪器

4.2 方法

4.2.1 体外增殖试验

4.2.2 体外入侵试验

4.2.3 空斑试验

4.2.4 逸出试验

4.2.5 小鼠体内毒力试验

4.2.6 样品的制备

4.2.7 血清中循环抗原检测

4.2.8 血清中抗体检测

4.2.9 小鼠腹腔弓形虫计数

4.2.11 统计分析

4.3 结果与分析

4.3.1 体外增殖试验

4.3.2 体外入侵试验

4.3.3 空斑试验

4.3.4 逸出试验

4.3.5 1000个速殖子攻虫对小鼠毒力的观察

4.3.6 100个速殖子攻虫对小鼠毒力的观察

4.3.7 血清中循环抗原水平检测

4.3.8 血清中抗体水平检测

4.3.9 体内增殖试验

4.4 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

作者简历