牛肠道菌群携带耐药基因分析与志贺菌分离、分型及耐药性研究

摘要

抗生素的发现与应用对人类的文明发展具有不可磨灭的贡献，但随着抗生素的不合理使用和滥用，抗生素残留和耐药性的广泛传播已严重危害畜牧业健康发展和公共卫生安全。近年来科学家们已经意识到耐药菌的流行病学研究和耐药基因水平转移的重要性，并对细菌耐药性的传播机制进行了探索。本文分两条主线对耐药性进行研究，一是从宏基因组角度，分析了不同养殖环境下牛肠道菌群耐药基因的差异;二是从病原菌角度，分析牛源志贺菌的流行病学以及耐药谱、耐药基因和毒力基因的流行特征。　　1.通过宏基因组方法，从宏观角度对来自甘肃不同地区和养殖环境下的牦牛、肉牛、奶牛肠道菌群结构及耐药基因储存库进行了综合研究。无论是在肠道菌群携带耐药基因的多样性还是丰度水平上，牦牛组均显著低于奶牛和肉牛组。　　2.分离鉴定了临床样品中的志贺菌，并确定了血清型。通过SS和麦康凯选择培养基筛选，16S rDNA、API20E生化试验、血清凝集试验、多重PCR血清鉴定法共鉴定得到136株志贺菌，其中福氏志贺菌54株、宋内志贺菌44株、痢疾志贺菌38株。填补了西北地区牛源志贺菌研究的空白，也为之后动物源志贺菌的研究奠定了基础。　　3.建立了分别针对福氏志贺菌、宋内志贺菌、痢疾志贺菌的脉冲场电泳分型(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、多位点可变数串联重复分型(MLVA)三种分子分型方法，从不同方面揭示了不同来源菌株之间的亲缘关系和流行背景，以及分型特点与不同耐药表型菌株的内在联系。　　4.毒力基因流行性研究表明，ipaH、ial、sen、set1A、set1B、stx、ipaBCD7个毒力基因检出率最高的是ipaH(100％)和ipaBCD(9485％)，其次为ial(75％)和sen(6691％)。同时发现，set1A和set1B基因只存在于福氏志贺菌中，而stx基因只存在于痢疾志贺菌中。　　5.耐药基因检测与分型研究表明，51株三代头孢菌素耐药志贺菌中只检测到了TEM(100％)、OXA(8148％)、CTX-M(902％)三种β-内酰胺酶型，其中TEM和OXA型只有一个亚型，分别为TEM-1和OXA-1，CTX-M基因分为三个亚型，分别为CTX-M-3、CTX-M-14和CTX-M-79，其中CTX-M-14亚型检出率最高为7843％(40/51)，55株氟喹诺酮类耐药菌株中，只检测到gyrA和parC两个基因上的5个基因位点发生突变。其中gyrA基因突变分别为Ser83Leu(100％)、Asp87Asr/Tyr(6346％)、His211Tyr(5091％),parC基因突变分别为Ser80Ile(5091％)、Ser83Leu(5636％)，3种质粒介导的耐药基因检出率分别为aac(6')-Ib-cr(100％)、qnr(2545％)、qepA(364％)。　　6.痢疾志贺菌Sd170912株基因组包括1染色体和3个质粒序列。基因组共包含4796个基因，其中毒力相关基因有467个，耐药相关基因有96个。基因组组分分析发现，在23个基因岛中有6个耐药基因岛和13个毒力基因岛，8个前噬菌体序列中，3个携带耐药基因，7个携带毒力基因。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 抗生素耐药性

1．1．2 环境微生物中的耐药性及危害

1．1．3 人类活动对抗生素耐药性的影响

1．1．4 抗生素对环境微生物的影响

1．1．5 小结与展望

1．2 测序技术及其发展概况

1．2．2 第二代测序技术

1．3 志贺菌研究进展

1．3．3 志贺菌的血清型特征

1．3．5 动物源志贺菌研究进展

1．4 研究目的与意义

第二章 牛肠道菌群耐药基因的宏基因组学研究

2．1 样品及试剂、仪器

2．1．2 主要试剂与仪器

2．2 试验方法

2．2．3 DNA文库构建

2．2．4 序列测定

2．2．5 信息分析流程

2．3 结果与分析

2．3．1 基因组提取结果

2．3．2 测序数据

2．3．3 序列组装

2．3．4 基因预测

2．3．5 物种注释

2．3．6 耐药基因注释及分析

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 牛源志贺菌的分离与鉴定

3．1．3 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．3 16S rDNA鉴定

3．2．4 生化鉴定

3．2．5 血清型鉴定

3．2．6 其他病原菌鉴定

3．3．1 细菌分离鉴定结果

3．3．2 志贺菌生化鉴定

3．3．3 志贺菌血清型鉴定

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 牛源志贺菌的分子分型

4．1 材料与仪器

4．2．1 PFGE

4．2．2 MLST

4．2．3 MLVA

4．3 结果与分析

4．3．1 福氏志贺菌分型结果

4．3．2 宋内志贺菌分型结果

4．3．3 痢疾志贺菌分型结果

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 志贺菌分离株毒力及耐药性分析

5．1 材料及仪器

5．1．4 药敏纸片

5．2．2 毒力基因检测

5．2．3 药敏试验

5．2．4 耐药基因检测

5．3 结果与分析

5．3．3 药敏试验结果

5．3．4 耐药基因检测

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 痢疾志贺菌Sd170912基因组分析

6．1 样品及仪器

6．2 试验方法

6．2．3 生物信息分析

6．3 测序结果及分析

6．3．1 数据概况

6．3．2 基因组概况

6．3．3 基因组组分分析

6．3．4 基因功能分析

6．3．5 毒力和致病性分析

6．3．6 耐药基因分析

6．4 讨论

6．5 小结

第七章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历