微流控芯片高效捕获乳腺癌细胞MDA-MB-231及再培养研究

摘要

近年来，乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，发病率高，大多与抑癌基因发生基因突变密切相关，从而导致正常细胞癌变。恶性肿瘤的转移是癌症患者病情复发或者死亡的主要原因。传统的用于检测肿瘤的方法如血清肿瘤标志物和影像学诊断对肿瘤发生早期的检出率均较低，所以有效地检测肿瘤早期的微小转移一直是临床医学面临的挑战。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是存在于很多肿瘤患者体内的肿瘤细胞，它由原发灶脱落后进入人体循环或淋巴系统，并通过外周血转移至远端的组织或者器官甚至遍布全身。循环肿瘤细胞具有上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和一些肿瘤干细胞的生物学特性，所以在循环系统中能够进入血管、快速增殖并形成转移瘤。很多研究都表明循环肿瘤细胞的迁移、粘附等与癌症的转移和预后复发均有密切关系。所以，循环肿瘤细胞具有很重要的临床意义，对早期诊断、预后判断、疗效检测和靶向药物的开发等提供理论基础。在全血中的循环肿瘤细胞与血细胞数相比极少，对其进行分离、检测和纯化仍具有一定的挑战性。目前主要依据肿瘤细胞的大小、细胞形态、细胞密度和肿瘤细胞独特的生物学特性对循环肿瘤细胞进行分离，包括过滤法、密度梯度离心法、细胞表面电荷法和免疫磁珠法等。对循环肿瘤细胞的检测主要从细胞计数和核酸表达分析两个方面进行。研究者一直致力于循环肿瘤细胞的富集、检测和纯化技术的研究，希望能够找到高效捕获肿瘤细胞的方法并将其应用于临床检测。微流控芯片是近几年飞速发展的一种对CTCs进行快速检测和操控的技术。它具有可控的单元集成模式和微尺度结构，可实现样品处理、捕获和检测一体化，降低试剂和样品量的消耗，能实现快速、高效、高通量的分析，获得更多有关CTCs的信息。MUC1是一类高分子糖蛋白，正常细胞中低表达，在癌细胞和癌组织中高表达并以畸形糖基化和糖基化不完全两种形态存在，从而使抗原分布在癌细胞表面，可被特异性抗体识别。MUC1与腺癌特别是乳腺癌的癌细胞恶变、转移和浸润密切相关，其表达与乳腺癌术后复发、转移也具有相关性。
　　本研究利用微流控芯片作为载体，通过对芯片基底表面进行MUC1抗体修饰，利用抗原与抗体相结合的方法，实现了对人乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231的特异性捕获和研究。乳腺肿瘤细胞捕获的条件和环境严重影响了癌细胞捕获效率，因此筛选和优化捕获条件对于提高细胞捕获率很有必要。实验中从微流控基底表面的粗糙度、微流控孔道的花纹、抗体孵育时间、细胞样品注入流速、细胞注入芯片后在通道内停滞的时间等方面进行捕获条件优化，结果获得了较高的细胞捕获率。捕获后的乳腺癌细胞经过分离和再培养，进一步利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)分别分析芯片捕获是否影响乳腺癌细胞内基因表达水平变化。同时对抗肿瘤药物阿霉素(Doxorubicin)处理的正常和再培养的人类乳腺癌细胞MDA-MB-231中FN1、RUNX2、1TGA6MMP3、LAMB3和ERBB2基因表达进行相对定量分析。实验结果证明，利用微流控芯片能有效富集肿瘤细胞，捕获前后细胞内基因表达无显著差异，均能产生药物敏感性;为微流控应用于肿瘤的临床检测、诊断，肿瘤个性化治疗方案的选择及肿瘤药物的筛选等提供研究基础。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviations)

第1章 引言

1．1 循环肿瘤细胞的研究进展

1．2 循环肿瘤细胞的富集方法

1．2．1 物理富集方法

1．2．2 生物化学富集方法

1．3 循环肿瘤细胞的检测方法

1．4 循环肿瘤细胞富集与检测相结合的技术

1．5 微流控芯片的介绍

1．5．1 微流控芯片的概念

1．5．2 微流控芯片的材料

1．5．3 微流控芯片的制作方法

1．5．4 微流控芯片在CTCs检测中的应用

1．6 CTCs分子肿瘤标志物

1．7 阿霉素

第2章 材料和方法

2．1 实验材料和试剂

2．2 主要实验仪器

2．3 细胞实验

2．3．1 细胞复苏

2．3．2 细胞换液

2．3．3 细胞传代

2．3．4 细胞冻存

2．4 微流控芯片的制作

2．4．1 洗涤玻片

2．4．2 PDMS胶制备

2．4．3 芯片粘合

2．5 微流控基底进行量子点和抗体的修饰

2．5．1 微流控基底的量子点修饰

2．5．2 一抗修饰

2．5．3 荧光二抗的修饰

2．6 乳腺癌细胞的捕获及捕获条件的优化

2．6．1 抗体孵育时同的优化

2．6．2 最佳流速的选择

2．6．3 微流控孔道的不同纹路对肿瘤细胞捕获率的影响

2．6．4 肿瘤细胞在微流控芯片内孵育时间的筛选

2．6．5 微流控基底的粗糙度对肿瘤细胞捕获率的影响

2．6．6 条件优化后模拟肿瘤细胞的捕获

2．7 乳腺癌细胞捕获后进行释放的方法

2．8 乳腺癌细胞捕获后的再培养

2．9 利用微流控芯片捕获并收集经阿霉素处理的正常和再培养的乳腺癌细胞MDA-MB-231

2．9．1 乳腺癌细胞的培养

2．9．2 利用微流控芯片捕获阿霉素处理后的乳腺癌细胞

2．9．3 阿霉素处理正常和再培养的乳腺癌细胞并收集

2．10 提取四组实验细胞内总的RNA并检测

2．10．1 提取RNA的方法如下

2．10．2 检测提取的RNA质量

2．11 RNA反转录合成cDNA

2．12 分析四组乳腺癌细胞MDA-MB-231中目的基因的表达水平

2．12．1 RT-PCR检测4组实验细胞中目的基因表达水平

2．12．2 利用Q-PCR对4组实验细胞中目的基因进行相对定量

第3章 实验结果

3．1 微流控芯片装置的制备结果

3．1．1 微流控芯片系统装置的组成

3．1．2 微流控芯片的基底修饰结果

3．1．3 抗体修饰结果

3．2 乳腺癌细胞捕获条的件优化结果

3．2．1 抗体孵育时间的优化结果

3．2．2 最佳流速的选择结果

3．2．3 微流控孔道的不同纹路对肿瘤细胞捕获的结果

3．2．4 细胞在微流控芯片内孵育时间的筛选结果

3．2．5 微流控基底粗糙度对肿瘤细胞捕获的影响

3．2．6 模拟肿瘤细胞的捕获结果

3．3 细胞捕获后释放的结果

3．3．1 直接利用高速冲洗的方法得到的结果

3．3．2 直接利用胰酶消化细胞的释放结果

3．3．3 胰酶消化和高流速冲洗相结合的释放结果

3．4 乳腺癌细胞捕获后的再培养结果

3．5 微流控芯片对经阿霉素处理的乳腺癌细胞MDA-MB-231进行捕获的结果

3．6 对四组乳腺癌细胞MDA-MB-231中目的基因表达水平分析的结果

3．6．1 四组细胞RNA提取后电泳结果

3．6．2 RT-PCR检测4组实验细胞中目的基因表达水平

3．8．3 利用Q-PCR对4组实验细胞中目的基因进行相对定量的结果

第4章 分析与讨论

参考文献

致谢

硕士期间发表论文