生物表面活性剂的合成及其在蒽降解中的应用

摘要

本实验利用油平板筛选法和排油圈法，从辽河某油田土壤中分离筛选出3株高效的生物表面活性剂产生菌，并将其分别命名为:A3、As、Y，其发酵液的表面张力值分别为35.7 mN/m、37.5 mN/m、34.7 mN/m，排油圈直径均达到了5 cm，具有良好的表面活性。通过16s rRNA基因序列分析对所筛选菌株进行分子生物学鉴定，确定其种属，并对其所产生的生物表面活性剂进行提取以进行薄层色谱分析，进而确定该生物表面活性的种类。结果表明，3株菌均为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。以表面张力值为考察依据，对菌株A3、As、Y及3株菌的混合菌的发酵培养条件进行了L16(45)正交优化实验，选取的因子为培养温度、培养基pH值、NaCl浓度、碳源浓度和氮源浓度。其中菌株A3的最佳发酵条件为:培养温度为30℃、pH为6.0、NaCl浓度为4g/L、葡萄糖浓度为35 g/L、硝酸钠浓度为4 g/L。
　　采用5种提取方法对优化后发酵液中的生物表面活性剂进行提取。菌株A3、As、Y和A3-As混合菌的生物表面活性剂提取量较优化前有明显的提高，其产量分别是优化前的8.4倍，6.4倍，5.6倍和5.7倍，其中，菌株As的生物表面活性剂产量最高，可达20.55 g/L。对于3种纯菌和A3-As混合菌而言，5种提取方法中均以CHCl3萃取的量最高;而对其他混合菌，5种提取方法的差别并不显著。
　　菌株A3所产生物表面活性剂的临界胶束浓度值(Critical MicelleConcentration，CMC)经实验确定为200 mg/L，其CMC值较低。生物表面活性剂的稳定性是表征它优良性能的一个重要指标，因此对菌株A3所产生物表面活性剂进行了酸碱度、温度及矿化度的稳定性研究，发现温度从15.2℃～150℃，表面张力值的波动范围很小，均保持在47 mN/m左右。氯化钠浓度从0g/L加至饱和，表面张力值基本上保持在42 mN/m左右。pH值在2.0～6.0范围内变化时，表面张力值从31 mN/m升高到50 mN/m，在pH6.0～pH13.0范围内，表面张力值保持在50 mN/m左右。可见菌株A3所产生物表面活性剂在极端的环境下仍能保持优良的生物活性，为其在实际环境中的应用奠定了基础。
　　蒽的生物降解实验包括:乳白耙齿菌F17对蒽降解情况的探究，生物表面活性剂的添加浓度、投加时间、降解体系的温度、酸碱度对蒽降解的影响;木屑的加入对蒽降解效果的影响;蒽降解过程中乳白耙齿菌F17分泌的胞外酶活性的变化。结果表明，在不投加生物表面活性剂时，乳白耙齿菌F17对蒽的降解率在15d后可达到59.0％;而生物表面活性剂的加入则能显著提高蒽的降解率，并且在100～1000 mg/L的范围内，随着生物表面活性剂投加量的增加，降解率也随之明显增大，第15d蒽的降解率达到了93.3％。生物表面活性剂的投加时间、降解体系的温度、酸碱度及木屑对蒽的降解效果都有一定的影响，生物表面活性剂在乳白耙齿菌F17前1d加入培养基中，能促进蒽的溶解，有利于乳白耙齿菌F17对蒽的利用，提高降解率。酸碱度对微生物的生长有较大影响，pH值在5.0时乳白耙齿菌F17对蒽的降解效果最好。温度对蒽的降解也有一定的影响，28℃～30℃是乳白耙齿菌F17降解蒽的最适温度范围。在培养基中加入木屑对乳白耙齿菌F17合成降解酶有诱导作用，从而提高了该菌对蒽的降解率。乳白耙齿菌F17分泌的锰过氧化物酶(MnP)、木质素过氧化物酶(LiP)和漆酶(Lac)在降解过程中都能检测到，但在蒽的生物降解过程中，漆酶和木质素过氧化物酶可能起了主要作用。
　　本研究结果为高效产生物表面活性剂的合成提供了新的菌源，也为生物表面活性剂产量的提高及其高效提取提供了适宜的方法。其优良的表面活性稳定性推动了生物表面活性剂应用领域的拓展，能够为新型生物表面活性剂的开发及其应用奠定基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 多环芳烃的来源

1．2 多环芳烃的危害

1．3 多环芳烃的治理方法

1．3．1 物理法

1．3．2 化学法

1．3．3 生物法

1．4 生物表面活性剂概况

1．4．1 生物表面活性剂定义

1．4．2 生物表面活性剂的特性

1．4．3 生物表面活性剂产生菌的筛选方法

1．4．4 生物表面活性剂提取方法

1．4．5 生物表面活性剂应用

1．5 研究目的和意义

1．6 主要研究内容

1．7 技术路线

第二章 生物表面活性剂产生菌的筛选及鉴定

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 培养基

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的筛选

2．2．2 BS性能的测定方法

2．2．3 菌株鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 生物表面活性剂产生菌的筛选与鉴定

2．3．2 各菌株产生物表面活性剂的性能

2．3．3 生物表面活性剂的薄层色谱分析(TLC)

2．4 本章小结

第三章 生物表面活性剂合成及提取的方法研究

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 培养基

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 单因子实验

3．2．2 正交实验

3．2．3 生物表面活性剂的提取

3．3 结果与分析

3．3．1 单因子实验

3．3．2 正交实验

3．3．3 生物表面活性剂的排油能力

3．3．4 生物表面活性剂的表面张力

3．3．5 生物表面活性剂的提取

3．4 本章小结

第四章 菌株A3所产生物表面活性剂的稳定性研究

4．1 主要实验材料与仪器

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．2 实验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 菌株A3所产生物表面活性剂的CMC值

4．3．2 温度稳定性

4．3．3 pH稳定性

4．3．4 矿化度稳定性

4．4 本章小结

第五章 生物表面活性剂与蒽降解菌协同作用研究

5．1 实验材料与仪器

5．1．1 实验菌种

5．1．2 培养基与培养条件

5．1．3 主要试剂

5．1．4 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．1 乳白耙齿菌F17对蒽的降解实验

5．2．2 生物表面活性剂(BS)与乳白耙齿菌F17协同作用实验

5．2．3 乳白耙齿菌F17合成的降解酶活性的测定

5．3 结果与分析

5．3．1 标准曲线

5．3．2 生物表面活性剂与乳白耙齿菌F17的协同降解作用

5．3．3 蒽降解机理初探

5．4 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

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