社群环境下的短尾猴肠道微生物群落结构及适应进化

摘要

动物的起源与进化是生命科学和生态科学共同关注的重要科学问题。微生物与动物间经过长期的相互作用而协同进化，他们对动物的适应与进化具有重要作用，不可忽视。长期以来，受绝大部分肠道微生物难以分离培养的技术限制和定量开展研究困难等因素的影响，肠道微生物在动物适应与进化中的作用机制长期被忽视。近年来，生物信息分析方法与高通量测序技术的结合，为肠道微生物定量研究提供了更加精确和快捷的方法与手段，这一长期被忽视的领域，正在成为科学界关注的焦点。从肠道微生物入手，与早期的栖息地、食性、营养、免疫、行为等领域开展的动物适应与进化研究结果交叉，有望进一步揭示动物健康维持与适应性进化的机制，发展动物生态科学研究的新领域。
　　目前，大家普遍关心的问题是:哪些因素会影响寄主的肠道微生物多样性？大量的研究显示，内部和外部因素都会对寄主的肠道微生物多样性产生影响，例如寄主的遗传结构、饮食习惯、地理分布、环境温度等因子会对肠道微生物结构产生作用。除此以外，社会环境和社会交往也会对肠道微生物群落结构也具有重要影响，暗示肠道微生物对群体演化可能具有重要作用。但是，由于在社群背景下开展野生动物肠道微生物多样性的研究较少，有关社群对寄主肠道微生物群落结构的影响机制尚不清楚。
　　非人灵长类动物(Non-human Primate)拥有复杂多样的社会行为和相对稳定的社会结构，是深入探究社群结构与肠道微生物群落关系的理想对象。本课题组近30年长期跟踪研究的、栖息在安徽黄山的、国家二级保护野生动物—短尾猴（Macaca thibetana）是研究上述问题的理想对象。本研究通过对其肠道微生物多样性和进化适应开展研究，探讨社群背景下，短尾猴肠道微生物群落结构形成的影响因素及其对寄主食物资源动态变化的响应，期望回答以下重要科学问题:(1)短尾猴肠道微生物群落有哪些微生物类群组成？(2)社群结构（性别、年龄、亲缘关系）是否会对短尾猴肠道微生物群落产生重要影响？(3)群体生活对短尾猴肠道微生物群落结构影响的路径是什么？(4)短尾猴肠道微生物对食物资源的动态变化是如何响应的？主要研究结果如下:
　　一、发现短尾猴肠道微生物群落组成具有高度的植食性适应:主要表现为:(1)在门水平上，以分解利用植物的门类为优势种群。短尾猴的肠道微生物的优势门为厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，两者占总肠道微生物的比例高达78％以上。已有大量的研究结果显示:肠道中的厚壁菌门和拟杆菌门有利于动物消化利用来源于植物的食物资源。(2)在科水平上，短尾猴的肠道微生物也表现出了对植食性的高度适应。短尾猴肠道微生物占优势的科为胃瘤菌科(Ru minococcaceae)，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)。这些优势科在其它植食性哺乳动物的肠道中也表现出了较高的相对丰富度，有利于寄主分解利用来源于植物的复杂食物资源。(3)在属水平上，短尾猴肠道微生物群落组成再一次表明其对植食性的高度适应。短尾猴肠道中的优势属为普氏菌属（Prevotella）和琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）。已有研究显示，具有胃瘤动物的肠道中琥珀酸弧菌属的物种表现出较高的相对丰富度，他们在可以通过分解代谢来自于植物纤维素中的多糖，帮助寄主生产乙酸和琥珀酸等营养物质、协助寄主代谢长链脂肪酸;而普氏菌属中的物种在分解利用来源于水果、谷类和嫩叶中的半纤维素、果胶、淀粉、碳水化合物和单糖具有重要作用。因此普氏菌属和琥珀酸菌属在短尾猴肠道中的大量分布表明:肠道微生物对短尾猴高效利用包括树叶、树根、树皮、植物果实、种子等食物具有重要作用。
　　二、发现社群结构对短尾猴肠道微生物群落结构的影响较小。(1)短尾猴的肠道微生物组成和结构在性别间差异不显著。在门类水平上，不同性别间并未检测出显著的差异，在属类水平上，虽然检测出少量属在性别间存在显著不同，但这些属相对丰富度较低。除此之外，短尾猴性别间的Alpha多样性和Beta多样性也未产生显著的分化。(2)短尾猴的肠道微生物组成和结构在年龄组间差异不显著。在短尾猴的群体中，不同年龄组个体间的拟杆菌门和厚壁菌门并未表现出显著的差异，这与以往的研究有所不同。除此之外，也未在不同年龄组间产生差异。这些结果都表明，与年龄相关的肠道微生物菌群除了受到消化生理的影响外，可能还受到其他未知因素影响。(3)亲缘关系系数并未对短尾猴肠道微生物群落结构产生显著影响。在一些哺乳动物，不同物种间肠道的系统发育与物种的系统发育高度一致。然而，对于群体生活中的短尾猴个体，不同亲缘关系间并未表现出显著的不同，这与早期在冈贝国家公园黑猩猩群体内的研究结果一致。我们推测，群内个体间微生物的水平传播可能影响了亲缘关系个体间和非亲缘关系个体间肠道微生物群落的变异。
　　三、“粪便-口腔-肠道”是影响短尾猴肠道微生物在群体内传播的潜在重要路径。(1)野生短尾猴的口腔和肠道微生物群落的Alpha多样性和Beta多样性均显著不同。该结果表明短尾猴口腔和肠道内含有两种不同类型的微生态系统;而且，短尾猴不同个体间口腔微生物群落的相似性显著高于不同个体间肠道微生物群落的相似性，暗示微生物栖息地的开放程度影响不同个体间特定栖息地微生物群落的相似性。(2)短尾猴口腔微生物群落与肠道微生物群落仍存在着紧密联系。短尾猴的口腔和肠道核心微生物共享普氏菌属（Prevotella）、密螺旋体属（Treponema）和拟普雷沃菌属(Alloprevotella)，表明这三个属都可以在肠道和口腔微生态系统中建立自己稳定的种群，因此，短尾猴口腔中的这三种微生物类群对其在肠道中建立种群并长期维持可能具有重要的作用。另外，口腔和肠道共享的OTUs有413个，这些OTUs所对应的属占了肠道核心微生物的比例高达89％，该结果很好的支持了“粪便-口腔-肠道”传播路径假说。伴随着寄主进食行为的发生，这些存在于口腔中的肠道核心微生物极有可能迁移至肠道微生态系统，对肠道核心微生物的补充具有重要意义。
　　四、短尾猴肠道微生物群落结构与功能对食物资源的动态变化具有积极响应。(1)短尾猴肠道微生物组成和结构对食物资源的季节波动具有明显的响应。短尾猴的肠道微生物多样性（Alpha多样性和Beta多样性）在春季和冬季存在显著差异。冬季样本中琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）、梭菌属（Clostridium sensustricto）显著增加，对提高猴子在冬季消化纤维素和半纤维素的食物资源有利。然而，在春季，普氏菌属(Prevotella)的含量显著增加，普氏菌属对水果、谷物和嫩叶中的果胶、碳水化合物和单糖具有更高的利用效率，有利于短尾猴从嫩叶中获取能量，快速恢复因冬季寒冷产生的能量损失。(2)短尾猴肠道微生物组的功能对食物资源的季节波动具有明显的响应。PICRUSt分析结果表明，在冬季样本中，多糖生物合成和代谢途径有关的功能基因显著增加，表明野生短尾猴冬季的肠道微生物组成模式，对于利用难以消化的食物具有更高的效率。在春季样本中，与碳水化合物代谢和能量代谢通路相关的功能基因显著增加，表明春季肠道微生物群落的变化可能有利于快速恢复在冬季损失的能量和营养。(3)冬季样品间的肠道微生物群落结构差异显著高于春季样品间的差异。相对于春季的样品，冬季样品间肠道群落结构差异表现出显著增高的现象，表明个体间肠道群落结构在冬季差异更大，而在春季相似性更高。对这一发现可能的解释是冬天个体间存在着更紧张的食物竞争关系（食物缺乏时期），导致个体间食物资源获取的差异。而春天可利用食物的增加，个体间的食物竞争减少，具有更相似的食物摄入模式。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 肠道微生物概述

2 肠道微生物在动物生态研究中的应用

2．1 肠道微生物与动物营养

2．2 肠道微生物与动物健康

2．3 肠道微生物与动物行为

2．4 肠道微生物与群体演化

3 微生物生态研究技术的发展

4 短尾猴的特点及其优势

5 本研究的目的和意义

第二章 研究对象、研究内容与技术路线

1 研究对象

2 研究地点与研究群体

3 研究内容

4 技术路线

第三章 短尾猴肠道微生物群落组成

1 引言

2 研究方法

2．1 样本的采集与保存

2．2 样本信息

2．3 粪便总DNA的提取

2．4 粪便总DNA的质量检测

2．5 序列测定

2．6 数据分析

3 主要结果

3．1 短尾猴肠道微生物门类分布特征

3．2 短尾猴肠道微生物科类分布特征

3．3 短尾猴肠道微生物属类分布特征

3．4 短尾猴肠道核心微生物的组成

3．5 短尾猴肠道微生物的Alpha多样性评估

4 讨论

第四章 社群结构对肠道微生物群落的影响

1 引言

2 研究方法

2．1 样本的采集与保存

2．2 样本信息

2．3 粪便总DNA的提取

2．4 粪便总DNA的质量检测

2．5 序列测定

2．6 数据分析

3 主要结果

3．1 雌雄间肠道微生物群落组成和功能的差异

3．2 雌性与雄性间肠道微生物群落多样性的差异

3．3 成年与亚成年间肠道微生物群落组成与功能的差异

3．4 成年与亚成年间肠道微生物群落多样性的差异

3．5 亲缘关系对肠道微生物群落结构的影响

4 讨论

第五章 短尾猴肠道微生物受社群生活的影响

1 引言

2 研究方法

2．1 口腔微样本采集与总DNA提取

2．2 粪便样品总DNA提取

2．3 总DNA的质量检测

2．4 序列测定

2．5 数据分析

3 主要结果

3．1 肠道与口腔间的肠道微生物多样性的差异

3．2 肠道微生物群落与口腔微生物群落间的联系

4 讨论

第六章 短尾猴肠道微生物的适应性进化

1 引言

2 材料与方法

2．1 样品收集

2．2 粪便总DNA的提取

2．3 粪便总DNA的质量检测

2．4 序列测定

2．5 数据分析

3 研究结果

3．1 短尾猴冬春季的肠道微生物群落组成的差异

3．2 冬季和春季肠道微生物多样性的差异

3．3 冬季和春季宏基因组的差异

4 讨论

第七章 总结

1 主要结论

2 课题创新

3 研究展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表学术论文

攻读博士学位期间参与项目

攻读博士学位期间所获奖励