女贞子浸提液对铜绿微囊藻化感抑制作用与机理的研究

摘要

随着世界范围内淡水富营养化程度不断加剧，藻类水华不断爆发，以铜绿微囊藻水华最为常见。寻求安全可靠、高效廉价的水华控制方法一直是水生态保护领域的热点课题。陆生植物来源广生物量大，其化感抑藻作用快速易控危害小，因而利用陆生植物进行化感抑藻成为水华控制的新途径。本文以水华优势种----铜绿微囊藻为对象，首次系统地研究了女贞子浸提液对铜绿微囊藻的化感抑制作用及机理。通过女贞子浸提液及其制备条件对铜绿微囊藻生长影响的实验确定了女贞子浸提液的抑藻作用，并建立了化感抑藻模型。通过对女贞子浸提液的逐级分离和活性测试，筛选出了有效化感物质并进行了结构鉴定。同时，从铜绿微囊藻细胞的生理学和形态学等方面对女贞子浸提液的抑藻机理进行了探讨。
　　本研究主要内容包括：⑴研究了5个浓度水平的女贞子浸提液(0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 g·L-1)对铜绿微囊藻的抑制作用。结果发现：所有处理组的藻细胞密度、叶绿素荧光强度和比例、代谢活力在一定时间内均出现较明显下降，用浓度2.0g·L-1和4.0 g·L-1的女贞子浸提液处理25天后的组分均检测不出藻细胞； PI染色和电镜观察:处理一天后的组分中，细胞膜开始出现破裂，并随着处理时间和剂量的增加而愈趋严重；浓度0.25 g·L-1的浸提液能够减缓藻细胞生长，属于“阻止型抑制剂”，浓度0.5g·L-1及以上的浸提液可以直接杀死藻细胞，属于“杀死型抑制剂”。结果表明:女贞子浸提液能够损坏藻细胞膜、影响藻细胞的光合作用效率和分裂增殖、降低藻细胞的酯酶活力，从而减缓藻细胞的生长或直接杀死藻细胞。⑵研究女贞子浸提液的化感效应和营养盐效应，建立化感抑藻模型。用不同前处理方法得到的女贞子浸提液，以梯度浓度方式加入相同接种量的铜绿微囊藻培养液中，进行化感抑藻测试。正交实验结果表明，女贞子浸提液的不同前处理方式对其抑藻效果有很大影响，抑藻效果最好(EC50=0.344)的前处理方式为:灭菌后在光照条件下无氧浸提。梯度试验表明，不同前处理方法得到的女贞子浸提液具有不同的营养盐效应，灭菌制备组中低浓度浸提液的营养盐效应很弱;而不灭菌处理得到的浸提液特别在高浓度添加量时，营养盐效应相对较强。不同处理方法得到的女贞子浸提液的化感抑藻效果有显著性差异;同组处理方法得到的浸提液，在不同添加浓度下也表现出差异显著的抑藻效果。用8组不同前处理6组不同添加浓度的浸提液抑藻结果建立毒理数据库，以An-Johnson-Lovetthormesis model与Logistic growth model相结合进行非线性拟合。结果显示，女贞子浸提液最低浓度的轻度促进作用和高浓度的快速抑制作用在拟合曲线中均有体现，各组的抑藻效果与模型有很好的拟合。⑶采用“萃取分离”与“活性跟踪”相结合的方法对女贞子浸提液中的抑藻成分进行初分离。结果表明，石油醚相和氯仿相对铜绿微囊藻无抑制作用，乙酸乙酯相的抑藻效果不显著，正丁醇相和水相在15天后的抑藻率分别为97.14％和100％。正丁醇相和水相对藻细胞中叶绿素a、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白的抑制率超过80％，使Ca2+Mg2+-ATPase酶活显著降低，使超氧化物歧化酶活力先升后降、过氧化物酶与过氧化氢酶的活力升高;水相组分在10天后检测不到藻细胞酶活。从而推断，正丁醇相和水相的抑藻机制可能是其中的有效成分能够消减藻细胞的光合色素，造成线粒体Ca2+外流，引起脂类过氧化，进而引起细胞膜损伤。PI染色证明，正丁醇相和水相能严重破坏藻细胞的细胞膜，其中的有效成分属于杀死型抑藻剂。⑷利用天然产物分离手段，对女贞子浸提液中的有效化感物质进行逐级分离。结果表明，水相7-1号细分组分的抑藻率近100％，经纯化、结构鉴定，有效化感物质为D-甘露醇，分子式为C6H14O6。D-甘露醇是一种天然糖醇，在医学上作为高渗透性脱水剂，D-甘露醇对铜绿微囊藻的高渗透性脱水作用可能是其抑藻的关键因素。正丁醇相4号粗分组分的抑藻率为100％，但细分组分的抑藻率皆不高，其抑藻效果可能是多个成分协同作用的结果，具体机理有待进一步研究。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 蓝藻水华概述

1．2 蓝藻水华的抑制方法

1．3 植物化感作用抑藻研究进展

1．3．1 水生植物

1．3．2 陆生植物

1．4 植物化感作用抑藻机理的研究进展

1．4．1 对藻细胞光合作用的影响

1．4．2 对抗氧化体系的影响

1．4．3 对细胞结构的破坏

1．4．4 对基因表达的影响

1．5 女贞子研究进展

1．5．1 女贞的生物学特性

1．5．2 女贞子的化学成分研究进展

1．5．3 女贞子的应用研究进展

1．6 研究目的与意义

1．6．1 研究目的

1．6．2 研究意义

1．7 研究思路

第二章 女贞子浸提液抑藻作用的研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 藻种及培养条件

2．2．2 女贞子浸提液制备方法

2．2．3 女贞子浸提液抑藻能力测试

2．2．4 女贞子浸提液抑藻效应测试

2．2．5 藻细胞自发叶绿素荧光测试

2．2．6 藻细胞细胞膜完整性测试

2．2．7 藻细胞内酯酶活性测试

2．2．8 藻细胞超微结构分析

2．2．9 藻细胞抑制指标比较

2．2．10 数据统计分析方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 女贞子浸提液对铜绿微囊藻生长特性的影响

2．3．2 女贞子浸提液的抑藻效应

2．3．3 女贞子浸提液对铜绿微囊藻自发叶绿素荧光的影响

2．3．4 女贞子浸提液对铜绿微囊藻新陈代谢活力的影响

2．3．5 女贞子浸提液对铜绿微囊藻细胞超微结构的影响

2．3．6 藻细胞抑制指标比较

2．4 小结

第三章 女贞子浸提液制备条件的筛选及化感抑藻模型的建立

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 女贞子基本指标测试

3．2．2 女贞子浸提液制备方法

3．2．3 影响浸提液抑藻能力的因素实验

3．2．4 化感抑藻模型的建立

3．2．5 数据统计分析方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 女贞子与女贞子浸提液的物理化学指标

3．3．2 浸提液制备方法对抑藻效果的影响

3．3．3 女贞子浸提液化感抑藻模型

3．4 小结

第四章 女贞子浸提液中化感抑藻物质的初分离

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 植物材料及藻种

4．2．2 萃取分离设计

4．2．3 萃取相的抑藻能力测试

4．2．4 藻细胞光合色素测试

4．2．5 藻细胞细胞膜完整率测试

4．2．6 藻细胞细胞酶活测试

4．3 结果与讨论

4．3．1 女贞子浸提液各萃取相的抑藻效应

4．3．2 女贞子浸提液各萃取相对藻细胞光合色素的影响

4．3．3 女贞子浸提液各萃取相对铜绿微囊藻细胞膜完整性的影响

4．3．4 女贞子浸提液各萃取相对藻细胞抗氧化酶活力的影响

4．4 小结

第五章 女贞子浸提液中化感抑藻物质的进一步分离与鉴定

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 材料

5．2．2 分离设计

5．2．3 抑藻能力测试

5．2．4 化感组分的粗分离

5．2．5 有效粗分组分的细分离

5．2．6 有效细分组分的进一步细分离

5．2．7 有效化感物质的结构鉴定

5．3 结果与讨论

5．3．1 女贞子浸提液有效萃取相的HPLC分析

5．3．2 粗分组分的抑藻效果及化学分析

5．3．3 细分组分的抑藻效果及化学分析

5．3．4 有效细分组分的化学分析及抑藻效果

5．3．5 有效化感物质的结构鉴定

5．4 小结

第六章 总结

6．1 主要结论

6．2 创新点

6．3 后续研究与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文