构建随机突变文库筛选敏感生物元件实现TNT的检测

摘要

合成生物学是21世纪新出现的一门交叉学科，它将工程化的思想运用到系统生物学研究中，为解决人类在医疗、环境及能源等方面面临的难题提供了新技术、新思路。目前基于合成生物学技术构建的生物传感器在环境污染物检测领域表现出了良好的发展势头。有特定感应功能的生物识别元件和可将信号进行放大输出的报告元件构成了生物传感器的核心。其中的生物识别元件通过感应并结合被测物质后，引发自身的生物学反应，进而导致下游报告元件的信号表达，信号强度代表生物元件对靶标化合物的感应强度。目前报告元件的研究相对成熟，而感应环境中靶物质的生物识别元件还有待大量挖掘、鉴定和优化，它是生物传感器选择性测定的基础。2，4，6-三硝基甲苯(TNT)是一种带苯环的有机化合物，因其良好的爆炸性能，常被用来制造地雷以及各种炸药。地雷的广泛使用以及TNT的长效性，导致战争遗留下来的地雷每年都在造成上百人的伤亡，严重威胁着人们的生命安全。同时泄露在环境中的TNT还是一种重要的环境污染物，不仅可以大面积地污染土壤和水域，产生极难清理和净化的“粉红水”，而且TNT及其降解物还可以进入食物链，对生态环境和人类健康都造成了极大威胁，因此，研发高效、准确的检测TNT的工具，对战后雷场清除以及环境治理都有重要意义。目前的检测方法大都需要昂贵的仪器以及专业的操作流程，在实际应用中会受到很大的限制。由于生物传感器具有成本低、敏感度高、易携带及易操作等优点，因此可作为传统方法的辅助手段，用于TNT的检测。
　　本研究主要内容包括：⑴根据差异荧光诱导技术的原理，进行生物元件的筛选，首先需要构建良好的筛选平台。pPROBE-TT是无启动子、带有绿色荧光蛋白(GFP)、进行高拷贝复制的载体，我们用大肠杆菌的低拷贝复制子pSC101 ori替换掉pPROBE-TT载体上的pBBR1 oriV的高拷贝复制子，构建低拷贝严谨型复制的筛选载体101-pPROBE。将用于指示TNT的生物元件插入GFP上游的多克隆(MCS)位点，GFP的荧光强度即可指征生物元件对TNT的感应强度。⑵采用启动子非保守序列随机化的方法构建随机启动子文库，通过分析启动子的一致序列，保留-35区及-10区，其余部分进行完全随机合成，退火后连入构建好的严谨型低拷贝筛选载体101-pPROBE内。通过对文库进行筛选，获得了一个启动元件5M6A，其对TNT及其靶标化合物表现出了较高的感应强度、灵敏度及特异性。⑶基于合成生物学的思想，优化设计该通路并导入遗传背景清楚、操作简单的大肠杆菌中构建全细胞生物传感器，用于检测TNT。我们以pETDuet-1为载体骨架，构建了XylR-Pu基因线路，并以GFP为报告分子，GFP的荧光值可以指征结合TNT后的XylR蛋白对Pu启动子的诱导强度，并在基因线路中加入四串联终止序列来降低背景值。最后对XylR蛋白的信号识别区进行连续易错PCR，构建随机突变文库。实验表明四串联终止序列可有效降低XylR-Pu通路的背景值，并从随机突变体文库中筛选出的蛋白元件eX0-4，对TNT表现出良好的感应强度、灵敏度以及特异性。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 绪论

1．1 合成生物学简介

1．2 生物传感器

1．2．1 工作原理

1．2．2 生物元件挖掘

1．3 生物传感器研究进展

1．4 研究思路及意义

1．4．1 2，4，6-三硝基甲苯

1．4．2 构建严谨型筛选平台

1．4．3 挖掘感应TNT的DNA元件

1．4．4 挖掘感应TNT的蛋白元件

1．4．5 目的及意义

第二章 低拷贝筛选平台的构建

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要溶液配制

2．1．4 主要仪器及耗材

2．2 实验方法

2．2．1 质粒提取

2．2．2 PCR扩增

2．2．3 PCR产物凝胶电泳

2．2．4 回收目的条带

2．2．5 TA克隆

2．2．6 化学转化

2．2．7 酶切鉴定

2．2．8 线性化载体的制备

2．2．9 PCR引物设计

2．2．10 PCR片段纯化

2．2．11 In-Fusion克隆

2．3 实验结果

2．3．1 PCR引物设计

2．3．2 pSC101低拷贝复制子扩增

2．3．3 pPROBE-TT线性化载体的制备

2．3．4 目的片段两端同源序列的引入

2．3．5 严谨型筛选载体101-pPROBE构建

2．4 本章小结

第三章 启动子文库的构建及DNA元件的挖掘

3．1 实验材料

3．1．1 菌株和质粒

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要溶液配制

3．1．4 主要仪器及耗材

3．2 实验方法

3．2．1 随机启动子的设计与合成

3．2．2 扩增产物清洁回收

3．2．3 随机启动子文库构建

3．2．4 文库筛选

3．2．5 特异性检测

3．2．6 时效性检测

3．2．7 灵敏度检测

3．2．8 测序分析

3．3 实验结果

3．3．1 随机启动子的设计与合成

3．3．2 文库筛选

3．3．3 特异性检测

3．3．4 时效性检测

3．3．5 灵敏度检测

3．3．6 测序分析

3．4 本章小节

第四章 XylR-Pu线路的构建及蛋白元件挖掘

4．1 实验材料

4．1．1 菌株和质粒

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要溶液配制

4．1．4 主要仪器及耗材

4．2 实验方法

4．2．1 目的基因序列的获得

4．2．2 PCR扩增

4．2．3 PCR产物凝胶电泳

4．2．4 基因线路X0-Duet及X5-Duet的构建

4．2．5 基因线路X0-Pu-Duet及X5-Pu-Duet的构建

4．2．6 基因线路X0-Pu-GFP-Duet及X5-Pu-GFP-Duet的构建

4．2．7 SDS-PAGE检测基因线路的蛋白表达

4．2．8 基因线路X0-4Ter-Pu-GFP-Duet及X5-4Ter-Pu-GFP-Duet的构建

4．2．9 基因线路检测TNT

4．2．10 易错PCR构建XylR突变体文库

4．2．11 文库筛选

4．2．12 特异性检测

4．2．13 固体平板荧光成像

4．2．14 灵敏度检测

4．2．15 蛋白结构分析

4．3 实验结果

4．3．1 基因线路X0-Pu-GFP-Duet／X5-Pu-GFP-Duet的构建及鉴定

4．3．2 SDS-PAGE检测基因线路XylR蛋白表达

4．3．3 基因线路X0-Pu-GFP-Duet／X5-Pu-GFP-Duet检测TNT

4．3．4 基因线路X0-4Ter-Pu-GFP-Duet／X5-4Ter-Pu-GFP-Duet的鉴定

4．3．5 基因线路X0-4Ter-Pu-GFP-Duet及X5-4Ter-Pu-GFP-Duet检测TNT

4．3．6 XylR0突变体文库的构建及筛选

4．3．7 特异性检测

4．3．8 固体平板荧光成像

4．3．9 灵敏度检测

4．3．10 测序分析

4．3．11 蛋白结构预测

4．4 本章小结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果