抗脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)感染新疗法研究

摘要

近年来，具有多重天然耐药性的新兴致病菌:脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus，Mab)，在临床感染的患者人数迅速增加，可用于治疗的抗菌药物严重匮乏，已经形成棘手的临床问题。然而Mab的药物筛选和检测体系的研究进展缓慢，严重制约着新药研发。本研究的主要目标是构建新型胞内和体内抗Mab药物筛选评价模型，并且基于这些模型筛选出可有效治疗抗Mab感染的新疗法。
　　本研究首先基于实验室前期构建的无抗性标记自主发光Mab(UAlMab)，建立了新型的巨噬细胞侵染模型，用于高通量药物组合筛选，该模型可以对同一个样品进行连续检测，检测过程迅速简便:无需传统模型的清洗、破膜、离心、平板计数等繁琐操作，仅需将孔板放入酶标仪检测即可（一块96孔板仅需10秒左右），同时检测成本极低（无需胰酶、培养基、平板等耗材）。
　　通过UAlMab和WtMab在小鼠体内的生长曲线对比，确认UAlMab可以代替WtMab用于体内模型构建。利用普通Balb/c鼠，我们构建了新型的Mab急性感染小鼠模型，用于药物体内活性的快速检测。该模型具有以下优点:(1)仅需2到4天即可初步判断药物是否具有体内活性;(2)感染方式便捷，检测时仅需使用发光仪检测小鼠（平均每只小鼠只需要15秒左右），整个过程操作简便，并且无需其他任何器械和耗材，成本极低;(3)同一只小鼠可以连续检测，大大减少了小鼠的用量，并且更具有统计学意义;(4)无需Nude或深度免疫缺陷型鼠，普通的BALB/c鼠也可用于建模，大大缩减了动物的购置和饲养成本。
　　为了更好地模拟在Mab的临床肺部感染患者，我们采用吸入暴露系统(GlasCol)进行Nude和NSI鼠的气溶胶感染，实验结果表明两种小鼠均可以用于Mab小鼠肺部感染模型构建。相较于传统的尾静脉注射感染方式，该气溶胶感染系统可较好地模拟呼吸系统感染并且感染的剂量均一可控。使用UAlMab进行小鼠气溶胶感染后，可以通过仪器检测小鼠肺组织研磨液的发光值，来判断肺部的菌载量。无需平板计数，可以很大程度上减少实验人员的工作量和实验成本，整个实验周期至少缩短一周，同时避免了平板计数法在培养过程容易出现污染的风险。
　　通过慢性肺部感染小鼠模型的结果发现，和治疗TB类似，氯法齐明（Clofazimine，CFZ）在治疗Mab感染时，也具有时滞性（即短期治疗无明显效果，需要较长的治疗周期，才能逐步显现出疗效）。然而使用氯法齐明长期治疗，会给患者带来严重的色素沉积，甚至有病人为此患上抑郁症而自杀。通过使用建立的药物筛选模型，我们针对氯法齐明进行组合筛选优化，获得了一个新的抗Mab药物组合疗法:氯法齐明、TB47以及罗红霉素(Roxithromycin，ROT)三种药物联合使用。其中氯法齐明可以显著抑制在罗红霉素治疗中出现的细菌再生。新化合物TB47单独在体外对Mab无明显治疗效果，然而其可以显著提高氯法齐明体外和体内的抗Mab疗效。三药联合使用不仅有效克服了大环内酯抗生素长期治疗肺部感染患者不佳的缺陷，同时起效更快，缩短了氯法齐明所需的治疗周期，可有效减少氯法齐明的副作用。另外为了验证本研究筛选出的药物组合是否具有广谱性，我们使用Alarm Blue法检测了20株不同的临床Mab菌株的药物敏感性。结果表明三种药物联合使用对20株菌株的生长抑制率都超过了84％，说明三种药物联合使用，极有可能是一个可有效治疗Mab肺部感染的疗法。
　　综上所述，本研究基于UAlMab成功构建了三种药物筛选评价模型，可以低成本、高通量以及快速地检测药物胞内和体内的抗Mab活性，同时利用模型筛选出的新药物组合（氯法齐明、TB47以及罗红霉素）具有显著的抗Mab活性，有望成为临床治疗Mab的新疗法。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 非结核分枝杆菌概述

1．2 脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus，Mab)概述

1．3 Mab的感染筒述

1．4 Mab的治疗简述

1．5 Mab疾病模型研究进展

1．6 研究的内容提要

2．1 实验材料

2．2 实验方法

第三章 结果与讨论

3．3 UAlMab和WtMab的体内生长曲线对比

3．4 急性感染小鼠模型构建

3．5 慢性肺部感染小鼠模型构建

3．6 新型斑马鱼模型构建

3．7 肺部感染小鼠模型药物活性验证

3．8 药物组合体外初筛

3．9 体内药物组合复筛

4．1 临床分离菌活性验证

4．2 讨论

4．3 展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果