基于萘酰亚胺的靶向定位检测溶酶体极性变化的双光子荧光探针

摘要

近些年来，由于生物成像设备不断得到更新和分子成像技术取得新的进展，体内荧光成像领域取得了很大的进步。目前在各类的技术中，荧光定量方法凭借其高灵敏度，非破坏性的快速分析等优点，可以做到在体内实时原位检测。它们有很好的细胞渗透性功能和对生物目标快速的响应速度，这对于体内检测和细胞成像是非常重要的。在生化研究方面，双光子技术目前已经成为一种新颖和富有创造力的工具。其具有降低活细胞和组织中的背景荧光，减少生物样品的光损伤，以及光漂白现象，提供更好的三维空间定位，并增加渗透深度等功能，因此双光子技术具有很好的应用前景，尤其是在对生物体系微环境的检测方面，相对于单光子技术和其他检测手段，具有其独特的优势。生物体的微环境因素主要包括极性、粘度、温度、pH、氧含量、酸性介质等。在众多的微环境参数中，极性占有很重要的地位。在细胞层面上，极性是一系列复杂机制的反馈形式，这些机制是细胞自身在特定的领域长期建立起来，用来维护其正常功能的运转。这些领域包括功能蛋白质的空间排列，蛋白质的组成过程，例如分化，局部膜生长，免疫激活反应，定向细胞迁移和矢量运输，所以极性的异常变化是与疾病密切相关的。例如糖尿病和肝硬化的发生均与其异常改变有直接关系，因此尝试采用双光子技术来检测极性很有现实意义。
　　溶酶体是细胞的垃圾处理“工厂”，由于其内环境是酸性介质，其中含有50多种水解酶，因此可以对细胞在代谢过程中产生的垃圾进行降解处理。目前学术界对溶酶体已经有了全新的认识，现在普遍认为溶酶体不仅仅是起到降解的功能，更是细胞稳态和适应压力的关键调节器。最近的证据表明，溶酶体在细胞内的分布影响调节细胞，以响应各种刺激，这种调节机制的改变与各种病症的发生有很大的关系。在这其中，极性对其功能的发挥有很大的影响，目前学术界对溶酶体的极性的研究并不多，挖掘背后的科学价值势在必行。
　　本文选取了萘酰亚胺作为荧光团，在此基础上引入双光子基团，根据其具有溶质变色效应的特点，设计出了两种新型的双光子极性荧光探针Lyso-NA和Lyso-NB，探针都是经过Sonogashira偶联反应生成得到.采用核磁氢谱、碳谱以及质谱等手段对其结构进行了确认。
　　针对探针的结构特点，首先对其在各种溶剂中的行为变化设计相关的实验，随后模拟生物体的内环境进行体外实验，采用的方式是研究探针在混合溶剂体系中的行为变化，结果均与设计思想完美契合。进一步开展探针在生物体中的应用试验，通过细胞毒性测试、溶酶体共定位、生物荧光成像等一系列实验，均得到了符合预期的实验结果。从结论上肯定了设计的原理正确性，同时丰富了对溶酶体微环境因素极性的研究，进一步填补了这方面研究的空白。
　　通过在萘二酰亚胺的酰胺氮原子上引入定位基团二乙氨基吗啉，4号位上接入强供电子基团4-甲氧基苯乙炔，合成得到探针Lyso-NA，在探针Lyso-NA分子结构中，4-甲氧基苯乙炔作为给体(D)，二乙氨基吗啉作为受体(A)，协同构成了一个典型的D-π-A结构。通过与上述一致的实验方式对探针Lyso-NA分子进行测试，发现其是一个优秀的双光子极性探针。值得一提的是，以萘酰亚胺为荧光团，主要是利用其荧光量子产率高、生物毒性低、具有良好的双光子性能等特点，更加有利于设计出优良的双光子极性探针，便于在生物体中的应用研究。
　　通过在萘二酰亚胺的酰胺氮原子上引入定位基团二乙氨基吗啉，4号位上接入供电子基团4-羟基苯乙炔，增大体系的共轭面积，形成一种经典推拉电子体系，设计出了探针Lyso-NB分子。在探针Lyso-NB分子结构中，4-羟基苯乙炔作为给体(D)，二乙氨基吗啉作为受体(A)，协同构成了一个典型的D-π-A结构，使其在结构上具有双光子诱导荧光的性质，并且通过相应的实验得到了肯定。通过对其在不同大小的极性溶剂以及甲醇-四氢呋喃混合体系中的光学数据进行分析，以及进一步通过如溶酶体共定位等实验，说明了探针Lyso-NB分子可以很好的定位于溶酶体中，并且对溶酶体中极性的变化有着很好的响应，可以实现对其变化的追踪。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 概述

1．2 双光子吸收理论

1．3 双光子技术的优势与不足

1．4 三光子技术

1．5 荧光传感器

1．6 极性荧光探针

1．6．1 极性荧光探针

1．6．2 极性荧光探针在亚细胞器中的应用进展

第二章 一种靶向定位检测溶酶体极性的双光子荧光探针的设计合成及应用

2．1 引言

2．3 实验仪器与试剂

2．4 Lyso-NA的合成及表征

2．4．1 Lyso-NA的合成步骤

2．4．2 Lyso-NA的合成

2．5 光谱测试条件

2．5．1 测试溶液的配置

2．5．2 Lippert-Mataga方程

2．5．3 荧光量子产率的测定

2．5．4 双光子测试

2．5．5 探针Lyso-NA的pH稳定性影响的测试

2．6 生物测试

2．6．1 细胞毒性测试

2．7．1 探针Lyso-NA在不同极性溶剂中的光学性能研究

2．7．2 探针Lyso-NA在四氢呋喃一水混合体系中光学性能研

2．7．3 探针Lyso-NA在水和四氢呋喃中光学行为变化与极性关系

2．7．4 探针Lyso-NA的pH稳定性影响的测试

2．7．5 探针Lyso-NA在不同粘度溶剂中的荧光光谱

2．7．6 探针Lyso-NA在四氢呋喃一水体系中的双光子吸收性能研究

2．7．7 探针Lyso-NA的理论验证

2．7．8 探针Lyso-NA的细胞毒性测试

2．7．9 探针Lyso-NA的溶酶体共定位实验

2．7．10 小鼠肝脏组织双光子荧光显微成像

2．7．11 溶酶体极性变化双光子荧光显微成像

2．8 本章总结

第三章 溶酶体极性荧光传感器的设计、检测及在生物体中的应用

3．1 引言

3．2 探针Lyso-NB的设计及作用原理

3．3 实验仪器与试剂

3．4 目标化合物Lyso-NB的合成以及结构的表征

3．4．2 荧光传感器(Lyso-NB)的合成及表征

3．5 光谱测试条件

3．5．1 测试溶液的配置

3．5．2 Lippert-Mataga方程

3．5．3 荧光量子产率的测定

3．5．4 双光子测试实验

3．6．2 探针Lyso-NB的定位溶酶体测试

3．7 结果与讨论

3．7．2 探针Lyso-NB在四氢呋喃一甲醇混合极性体系中的光学测试

3．7．3 探针Lyso-NB在四氢呋喃溶剂体系中的双光子吸收性能的研究

3．7．4 探针Lyso-NB的pH稳定性影响的测试

3．7．5 探针Lyso-NB的细胞毒性测试

3．7．6 探针Lyso-NB的溶酶体共定位实验

3．7．7 溶酶体极性变化双光子荧光显微成像

3．8 本章总结

第四章 总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文