靶向水溶性金纳米团簇及其复合物的荧光成像与抗肿瘤作用研究

摘要

癌症作为21世纪威胁人类健康和生命的最严重的疾病之一,实现癌症的早期诊断和有效治疗一直是癌症医学研究的焦点问题。一方面,荧光成像在细胞水平上具有很高的灵敏度和分辨率,被认为是一种有效的诊断方法。另一方面,光动力学治疗(PDT)和光热治疗(PTT)是微创肿瘤治疗方法,和传统的其他肿瘤治疗方法相比,比如化疗和放疗,PDT和PTT显示出副作用小、选择性高、治疗费用低等优点。因此,发展生物相容性好、靶向性好、光学特性优良、治疗效果好的功能化纳米材料对肿瘤细胞进行成像诊断和治疗,是要努力的方向。与传统的有机染料相比,水溶性金纳米团簇(AuNCs)由于具有优异的生物相容性、毒性低、超小的粒径和荧光强等优点成为新一代热门的诊疗试剂。本论文针对这一前沿研究方向,围绕水溶性AuNCs展开以下工作:
　　1、首先采用一步法合成由谷胱甘肽(GSH)保护的水溶性的具有高度荧光性能的AuNCs,通过配体交换法进一步合成同时含有线粒体靶向配体分子(4-巯基丁烷三苯基溴化膦,MTPB)和GSH保护的AuNCs。通过核磁氢谱(1H NMR)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)测试得出,这两种团簇的分子式分别为Au18SG14和Au18SG12MTPB2。通过细胞荧光成像实验发现,Au18SG14纳米团簇倾向于积累在细胞溶酶体部位,而Au18SG12MTPB2纳米团簇倾向于积累在线粒体部位,表明纳米团簇可通过配体的交换来实现细胞器的靶向转换。通过单线态氧(1O2)检测实验发现,在638nm的光照下两种团簇均可以明显产生一定数量的1O2,但是Au18SG12MTPB2纳米团簇产生1O2的效率要稍低于Au18SG14,可能是因为被替换掉两个-SG分子的结果。通过细胞毒性实验发现,虽然Au18SG12MTPB2纳米团簇的光动力效果不如Au18SG14纳米团簇的光动力效果显著,但是他们对细胞的杀伤效果却差不多,表明细胞内部线粒体的凋亡对细胞的影响比溶酶体的凋亡对其的影响更大。
　　2、首先采用双相法合成具有双层介孔孔道的硅纳米球(TMS),在其表面修饰上氨基以后,然后将上一章工作中合成的水溶性AuNCs通过静电吸附作用装载进入TMS内部,进一步通过酰胺反应包裹上明胶壳,接枝上靶向分子叶酸(FA)得到最终复合物——AuNCs@GTMS-FA。通过研究发现,AuNCs装载进入TMS后,其光稳定性得到很大的提升。通过荧光光谱分析表明AuNCs@GTMS-FA的荧光强度也有所提升,是单独AuNCs的3.3倍。在一定的光照下,该复合物不仅具有一定的光动力效果,还具备一定的光热转换的能力。经过808nm激光的9min的光照后,AuNCs@GTMS-FA分散液的温度能从起始温度22.6℃升高到43.7℃。细胞毒性实验表明,AuNCs@GTMS-FA复合物具有很好的生物相容性,能够特异性地靶向到癌细胞,在光照下做到对癌细胞选择性协同PDT/PTT杀伤效果同时减少对正常细胞的伤害。通过共聚焦荧光成像实验发现,AuNCs@GTMS-FA复合物在细胞内部的荧光稳定性比AuNCs要好得多,表明AuNCs@GTMS-FA复合物具有更好的荧光成像能力。
　　3、采用一步法合成透明质酸(HA)功能化的金纳米团簇(HG-AuNCs),然后进一步与氧化石墨烯(GO)复合得到最终产物——HG-AuNCs/GO。该复合物由于HA的存在可以特异性被某些肿瘤细胞表面的活化态CD44识别起到靶向运输的作用。HG-AuNCs与GO复合后,HG-AuNCs的荧光性质和产生1O2的能力会受到抑制,但是在细胞内透明质酸酶的作用下,HG-AuNCs会从GO表面释放出来,相应的性质也得以恢复。通过共聚焦荧光成像实验发现,不同癌细胞表面具有不同的CD44表达水平,其中A549细胞的CD44表达水平最高,因此A549细胞的荧光成像效果也最好。通过细胞毒性试验和活死细胞双染色实验发现HG-AuNCs与GO的复合能起到显著的对癌细胞的协同光动力和光热杀伤效果。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 肿瘤纳米诊疗平台研究现状

1．2．1 金纳米团簇(AuNCs)在肿瘤诊疗中的应用

1．2．2 介孔二氧化硅(MSN)在肿瘤诊疗中的应用

1．2．3 氧化石墨烯(GO)在肿瘤诊疗中的应用

1．3 肿瘤纳米诊疗中的靶向剂和相应的靶点

1．3．1 三苯基膦(TPP)和线粒体

1．3．2 叶酸(FA)及叶酸受体

1．3．3 透明质酸(HA)及其受体CD44

1．4 本论文的选题意义及研究内容

1．4．1 选题意义

1．4．2 研究内容

第二章 具有精确结构的荧光AuNCs的细胞器靶向转换成像和光动力抗肿瘤研究

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 实验设备及试剂

2．2．2 细胞来源及培养

2．2．5 Au18SG12MTPB2的制备

2．2．7 体外细胞毒性实验和光动力效果导致的细胞死亡实验

2．2．8 激光共聚焦成像(CLSM)和细胞器靶向性的观察

2．3 结果与讨论

2．3．1 纳米团簇的光学性质研究

2．3．2 纳米团簇的形貌与结构表征

2．3．3 Au18SG12MTPB2纳米团簇的电喷雾-电离质谱(ESI-MS)分析

2．3．4 核磁共振氢谱(1H NMR)分析

2．3．5 MTT实验

2．3．6 CLSM成像实验

2．3．7 光动力效果检测

2．3．8 细胞光动力杀伤效果检测

2．4 本章小结

第三章 靶向AuNCs@GTMS-FA复合物的构建及其荧光成像辅助的协同抗肿瘤研究

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1

3．2．2 细胞来源及培养

3．2．3 水溶性AuNCs的制备

3．2．4 TMS的制备

3．2．5 TMS在模拟体液(SRF)中的降解行为

3．2．6 AuNCs@GTMS-FA的制备

3．2．7 AuNCs标准曲线的绘制以及载药量和包封率的计算

3．2．8 AuNCs的释放量的测定

3．2．9 复合物在激光照射下的1O2产生能力和光热转换能力

3．2．10 细胞毒性检测实验

3．2．11 荧光显影观察

3．3 结果与讨论

3．3．1 产物的合成机理

3．3．2 产物的形貌分析

3．3．3 产物的内部孔结构分析

3．3．4 产物的物相分析

3．3．5 GTMS-FA复合物对AuNCs的装载量和释放量分析

3．3．6 GTMS-FA复合物的光稳定性分析

3．3．7 产物的荧光性质分析

3．3．8 产物的光动力学和光热转换性质分析

3．3．9 TMS的降解行为分析

3．3．10 细胞毒性行为

3．3．11 体外成像实验

3．4 本章小结

第四章 靶向HG-AuNCs／GO复合物的构建及其酶响应调控的荧光成像和协同抗肿瘤研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验设备以及试剂

4．2．2 细胞来源及培养

4．2．3 HG-AuNCs的制备

4．2．4 GO的制备

4．2．6 光照诱导的温度升高和1O2的产生

4．2．7 体外细胞毒性实验

4．2．8 细胞成像实验

4．2．9 活死细胞双染色实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 傅立叶转换红外(FTIR)光谱分析

4．3．2 透射电镜(TEM)测试

4．3．3 X射线光电子能谱(XPS)测试

4．3．4 圆二色谱(CD)测试

4．3．5 产物的光学性质分析

4．3．6 产物的光热转换性质分析

4．3．7 产物的光动力学性质分析

4．3．8 MTT试验

4．3．9 细胞荧光成像实验

4．3．10 活死细胞双染色实验

4．4 本章小结

5．1 全文总结

5．2 展望

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文